《European Journal of Cell Biology》：DAPK1 orchestrates cell division and junction to control corneal epithelial development
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本研究揭示了死亡相关蛋白激酶1（DAPK1）在角膜上皮发育中的关键作用，通过调控基底细胞分裂方向和细胞连接完整性维持角膜透明度，为角膜疾病治疗提供了新靶点。研究者利用基因敲除小鼠模型发现DAPK1缺失会导致角膜混浊、上皮增厚及表皮样病理转化，其分子机制涉及中心体定位异常和细胞连接蛋白（E-cadherin/ZO-1/Occludin）分布紊乱。
DAPK1：角膜透明度的守护者
在眼球最前部，角膜如同一个精密的光学镜头，其透明度对维持正常视力至关重要。这个透明结构由外至内包含上皮层、前弹力层、基质层、后弹力层和内皮层。其中角膜上皮作为最外层的防御屏障，其分层化结构的精确调控一直是眼科学研究的重点。近期研究发现，一个名为死亡相关蛋白激酶1（DAPK1）的分子在此过程中扮演着关键角色。
DAPK1表达与角膜上皮分层化同步升高
小鼠出生后角膜上皮会经历显著成熟过程。新生期仅1-2层细胞的角膜上皮，在睁眼期（P12-P14）开始分层化，到P28时发育为4-6层的复层上皮。通过生物信息学分析角膜转录组数据，研究者筛选出91个在分层化关键期（P14-P28）特异性上调的基因。基因本体分析显示"激酶活性"位列生物学功能首位，其中DAPK1的表达变化尤为显著。免疫印迹实验证实，野生型小鼠角膜上皮中DAPK1蛋白水平在P14至P28期间显著上升，提示其与分层化进程密切相关。
DAPK1定位于中心体并具有组织特异性
在人类角膜上皮细胞（HCE-2）中，免疫荧光显微镜显示DAPK1与中心体标志物γ-微管蛋白存在共定位，这种定位在细胞分裂间期和中期均持续存在。为深入探索其功能，研究者利用CRISPR/Cas9技术构建了Dapk1基因敲除小鼠模型，特异性敲除包含361bp编码序列的外显子3-4区域。通过PCR、免疫印迹和RT-qPCR在多水平验证了敲除效率。有趣的是，与细胞实验不同，小鼠角膜上皮中DAPK1的中心体特异性定位不明显，且蛋白表达具有组织特异性——主要集中在上皮层，基质层中几乎检测不到。
DAPK1缺失导致角膜表型异常
基因敲除小鼠出现了令人惊讶的表型：约14%的Dapk1缺陷小鼠出现角膜混浊和斑块形成，其中雌性小鼠表现更为普遍（20%），而雄性小鼠症状更严重。H&E染色显示，Dapk1敲除小鼠中央角膜上皮显著增厚，同时伴随基质层变薄。统计表明斑块面积约占眼表面积的36.8%，表明DAPK1缺失严重破坏了角膜的正常发育。
角膜上皮特性丧失与表皮样转化
角膜上皮特异性标志物角蛋白12（K12）的免疫荧光显示，敲除小鼠角膜中K12强度显著降低，免疫印迹进一步证实了蛋白水平的减少。相反，基底细胞标志物角蛋白14（K14）在敲除小鼠中强度增加，表明确层结构紊乱是上皮增厚的主因。更值得注意的是，表皮特异性标志物Loricrin在敲除小鼠角膜上皮中异常高表达，提示DAPK1缺失导致了角膜向上皮样病理转化。这些发现与Notch1、WNT7A或PAX6缺陷引起的角膜表型相似，揭示了DAPK1在维持角膜上皮特性中的重要作用。
细胞分裂方向调控异常
角膜上皮的稳态维持依赖于基底细胞的精确分裂。通过pH3（有丝分裂中期标志）和survivin（分裂末期标志）染色，研究者量化了基底细胞分裂轴与基底膜的角度关系。在野生型小鼠中，34%的细胞呈水平分裂（0-22.5°），49%为斜向分裂（22.5-67.5°），17%为垂直分裂（67.5-90°）。而Dapk1敲除小鼠中，垂直分裂比例显著增加至36%，水平分裂降至19%。这种分裂方向的紊乱导致过多基底上细胞的产生，破坏了正常的分层化进程。
细胞连接稳定性受损
细胞连接的完整性对角膜透明度至关重要。Phalloidin染色显示，敲除小鼠角膜上皮中F-肌动蛋白束排列紊乱，连接信号分布减少。E-钙黏蛋白（E-cadherin）在野生型角膜中集中分布于细胞皮层顶侧区域，而敲除小鼠中呈现弥散的胞质定位。紧密连接标志物ZO-1和Occludin也出现类似异常，在敲除小鼠中分布不规则。体外实验进一步证实，通过siRNA敲低HCE-2细胞中的DAPK1，同样破坏了肌动蛋白细胞骨架和粘附连接的组织结构。
讨论与展望
本研究首次揭示了DAPK1在角膜上皮发育中的关键作用。作为一种定位于中心体的激酶，DAPK1通过协调基底细胞分裂方向和维持细胞连接完整性，确保角膜上皮正常分层化和透明度。其缺失导致的分裂方向紊乱（垂直分裂增加）和连接蛋白分布异常，可能是上皮增厚和表皮样转化的结构基础。与C. elegans中的研究一致，DAPK1在角膜发育中的作用可能独立于其促凋亡功能，而主要依赖其激酶活性调控微管稳定性。这些发现不仅深化了对角膜发育分子机制的理解，也为角膜疾病的治疗提供了新的潜在靶点。
