《Fish & Shellfish Immunology》：The μ-class glutathione S-transferase (
SbGSTμ) involved in immune defense and detoxification in the ark shell
Scapharca broughtonii
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本研究通过RACE方法从石??大 clam（Scapharca broughtonii）中克隆获得μ类谷胱甘肽S-转移酶基因SbGSTμ，其全长cDNA为1040 bp，编码215个氨基酸的胞质蛋白。结构分析显示其具有保守的N端 thioredoxin样谷胱甘肽结合域和C端底物结合域。组织分布表明该基因在所有检测组织中均有表达，以足部最高。攻毒实验显示SbGSTμ mRNA在应对金黄色葡萄球菌、弧菌及Cu2?胁迫时显著上调。重组蛋白表达验证其最适活性温度30-40℃、pH7.4，并证实其通过降低8-OHdG水平参与毒素解毒，揭示GSTs在免疫防御中的双重功能。
张光明|黄永焕|李传传|马培珍|孙秀军|周丽青|刘志红|吴彪
中国渔业科学院黄海渔业研究所海洋养殖生物育种与可持续产品国家重点实验室，青岛，266071，中国
摘要
谷胱甘肽S-转移酶（GSTs）是一类多功能解毒同工酶的超家族，在先天免疫中发挥着重要作用。本研究采用RACE方法从Scapharca broughtonii中鉴定出一个μ类GST基因（命名为< />）。SbGSTμ的全长cDNA为1040 bp，编码一个由215个氨基酸组成的胞质蛋白。序列分析显示，SbGSTμ含有μ类GST家族的特征性结构域，包括一个具有谷胱甘肽（GSH）结合位点的N端硫氧还蛋白样结构域和一个含有底物结合位点的C端结构域。组织分布分析表明，SbGSTμ在所有检测的组织中均广泛表达，其中足部的表达水平最高。在受到金黄色葡萄球菌或鳗弧菌攻击，或暴露于Cu2+时，SbGSTμ的mRNA表达显著上调。重组SbGSTμ蛋白在大肠杆菌中成功表达、纯化并进行了功能鉴定。该酶在30°C至40°C的温度范围内以及pH 7.4条件下表现出最佳活性。此外，苯并[a]芘暴露实验表明SbGSTμ具有解毒能力，表现为8-羟基-2′-脱氧鸟苷（8-OHdG）水平的显著降低。综上所述，这些发现支持GSTs在异生物质解毒中的经典作用，同时也为它们在S. broughtonii的免疫防御机制中的作用提供了证据。
引言
谷胱甘肽S-转移酶（GSTs）是一类多功能酶的超家族，在异生物质解毒、氧化应激反应以及内源性化合物代谢中发挥着重要作用[1]。这些酶在动物、植物和微生物中普遍存在[2]。它们的主要催化功能是将谷胱甘肽与亲电底物结合，从而帮助机体排除毒素[3]。软体动物，尤其是滤食性物种，由于其生态相关性和对环境扰动的高敏感性，被广泛用作水生毒理学的生物指示剂[4]。因此，软体动物中的GSTs引起了大量研究兴趣。越来越多的证据表明它们在环境适应和抵御各种压力因素方面起着关键作用。例如，在Crassostrea gigas中，暴露于多环芳烃（PAHs）和重金属后，多种GST异构体会上调[5,6]。同样，Mytilus galloprovincialis中的GST活性在有机污染物和金属暴露下显著增强，这支持了其作为海洋环境监测生物标志物的应用[7]。此外，Bellamya aeruginosa在微囊藻毒素诱导的压力下表现出增强的GST表达，表明这种保护机制在软体动物中具有保守性[8]。
Scapharca broughtonii在其潮间带栖息地面临显著的生态压力，包括明显的温度波动和人为污染物的影响，这些都是已知的氧化应激诱导因素[9,10]。此外，该物种容易受到如Ostreid herpesvirus-1（OsHV-1）和Vibrio harveyi等病原体的大规模死亡事件的影响，感染结果具有明显的温度依赖性[11,12]。作为一种含有具有免疫功能的血红蛋白的红细胞的物种，S. broughtonii是研究综合应激和免疫反应的理想模型[13]。鉴于GSTs在解毒和免疫调节中的双重作用，对该生态和免疫独特双壳类动物中的μ类谷胱甘肽S-转移酶进行表征对于理解其对抗环境和生物压力的防御机制至关重要[14]。在本研究中，我们从S. broughtonii中克隆了一个μ类谷胱甘肽S-转移酶基因（命名为< />），并研究了其在受到金黄色葡萄球菌和鳗弧菌攻击以及Cu2+压力下的免疫反应中的作用。此外，我们还在大肠杆菌中异源表达了重组< />蛋白，并对其结构特征和在S. broughtonii病原体感染中的防御功能进行了研究。
实验动物
健康的S. broughtonii个体，平均壳长40 ± 5 mm，平均体重12.15 g，来自中国青岛胶南的一家商业水产养殖场。所有个体在30 L充氧海水中进行驯化，驯化条件为温度20°C、盐度30 psμ、pH 8.0，光照周期为12小时。海水每24小时更换一次，每次更换一半。
SbGSTμ的分子特征和系统发育分析
为确保数据可靠性，通过检查色谱图和验证contig组装来评估测序读数的质量（图1）。
SbGSTμ的全长cDNA（GenBank登录号
KT362153）长度为1040 bp，包含144 bp的5′-UTR、248 bp的3′-UTR（含有polyadenylation信号AATAAA）以及648 bp的开放阅读框（ORF），编码215个氨基酸残基（图2）。
SbGSTμ蛋白的预测分子量为24.9 kDa。
讨论
GSTs通过促进GSH与外来物质的亲电基团结合，将其转化为亲水性化合物以便排出体外，从而帮助软体动物进行细胞解毒和抗氧化防御[22]。本研究成功克隆了S. broughtonii中的SbGSTμ全长cDNA。功能域的预测表明其存在GSH结合位点。
结论
本研究从S. broughtonii中克隆了SbGSTμ的全长cDNA，并进行了全面的生物信息学分析。定量实时PCR（qRT-PCR）结果显示，SbGSTμ在所有检测的组织中均持续表达，包括血细胞、足部、鳃、外套膜、内收肌和肝胰腺，但转录本丰度存在显著差异。重组SbGSTμ蛋白在30°C至40°C的温度范围内表现出峰值酶活性，最大活性出现在pH 7.4时。
CRediT作者声明
作者贡献 所有作者都对本研究做出了重要贡献。张光明和黄永焕构思了研究方案，设计了实验框架，进行了分子实验，分析了数据，并起草了原始手稿。李传传和马培珍负责细菌培养并提供了用于挑战实验的病原菌株。孙秀军和周丽青进行了Cu2+暴露实验。刘志红进行了细菌鉴定。
致谢
本研究得到了山东省自然科学基金（ZR2022M-C095）和中科院中央公益性科学事业费基础研究基金（2023TD31）的资助。
