铁饱和度对热处理后牛、山羊和绵羊乳铁蛋白理化性质及抗菌活性的影响

《Food Bioscience》：Impact of Iron Saturation on the Physicochemical Properties and Antibacterial Activities of Bovine, Caprine, and Ovine Lactoferrin after Thermal Treatment

乳铁蛋白（LF）热稳定性和抗菌活性受物种及铁饱和度影响显著。研究对比牛、山羊、绵羊LF在apo、native、holo-60%、holo-80%铁饱和度下，65-85℃加热10分钟后的聚集性、结构变化及抗菌活性。结果表明：铁饱和度提高增强热稳定性，holo-80% BLF最耐热；物种间热敏感性和抗菌活性差异明显，CLF抗菌活性最佳，OLT最差；加热温度升高导致抗菌活性下降，但铁饱和度高的LF更稳定。摘要结束分隔符：

　　

余宇|张琳娜|夏思全|托尔迪·盖尔盖利|科尼什·吉莉安|胡珀茨·汤姆|周鹏

江南大学食品科学与技术学院，中国江苏省无锡市 214122

摘要：

乳铁蛋白（LF）被广泛用作功能性成分。其热稳定性随铁饱和度的增加而提高，但不同物种之间的热诱导变化可能有所不同。本研究探讨了在铁饱和度分别为无铁（apo）、天然状态（native）和全铁饱和（holo-60%及holo-80%）的情况下，加热对牛乳铁蛋白（BLF）、山羊乳铁蛋白（CLF）和羊乳铁蛋白（OLF）的影响。样品在65°C、75°C和85°C下加热10分钟，未加热的LF作为对照；评估了热聚集、构象变化和抗菌活性。加热导致LF的浊度增加并促进了其聚集。对于蛋白质二级结构，α-螺旋含量减少而β-折叠片层含量增加。加热还增加了疏水基团的暴露。较高的铁饱和度提高了LF的热稳定性。对于无铁和天然状态的LF，热诱导的变化程度依次为CLF < BLF < OLF。在全铁饱和状态下，holo-80%的BLF对热最不敏感。此外，holo-60%的CLF和OLF在65°C和75°C加热时比holo-60%的BLF更敏感，但在85°C加热时敏感性降低。未加热和加热后的holo-LF均无抗菌活性，而无铁和天然状态的LF对单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）的抗菌活性强于对大肠杆菌（Escherichia coli）的抗菌活性，并且随着加热温度的升高，抗菌活性下降。经过相同的热处理后，物种间的差异超过了铁饱和度的影响：抗菌效力排序为CLF > BLF > OLF。这些发现揭示了三种物种的LF在铁饱和度不同时的热稳定性和抗菌活性的差异，为选择LF来源和铁饱和度以更好地保持加工过程中的抗菌功能提供了指导。

引言

乳铁蛋白（LF）是一种约78 kDa的铁结合糖蛋白，属于转铁蛋白家族，广泛存在于大多数哺乳动物的乳汁以及各种外分泌液中（Li等人，2019b）。其在乳汁中的浓度因物种而异，人类乳汁中约为2-3 g/L（Wang等人，2019），牛乳中为0.03-0.49 g/L（Wang等人，2019），山羊乳中为0.02-0.20 g/L（Claeys等人，2014），羊乳中约为0.14 g/L（Navarro等人，2018）。结构上，LF由一条689个氨基酸组成的多肽链构成，折叠成两个同源的叶状结构（N叶和C叶），通过一个短的三螺旋结构连接（Dyrda-Terniuk和Pomastowski，2023）。每个叶状结构包含两个结构域，每个结构域可以结合一个三价铁离子（Fe3?）（Rosa等人，2017）。根据铁饱和度，LF可分为无铁LF（铁饱和度<5%）和全铁饱和LF（完全饱和有两个Fe3?），而天然状态的LF则是无铁、全铁饱和和单铁饱和形式的混合体（Dyrda-Terniuk和Pomastowski，2023）。LF的两个叶状结构在铁结合和释放方面表现出不同的行为。在铁结合过程中，Fe3?首先与C叶结合，这促进了与N叶的结合，表明这是一种协同结合机制（Abdallah和Chahine，2000）。相反，在酸性条件下，铁的释放依赖于叶状结构，N叶在稍高的pH值下释放铁（Wang等人，2019）。

铁饱和度显著影响LF的构象和功能特性。较高的铁饱和度使蛋白质结构更加紧凑（Wang等人，2013），从而提高其对热诱导变性的抵抗力。我们之前的差示扫描量热法（DSC）分析表明，天然状态的LF表现出两个吸热转变，变性峰值分别为60-63°C和84-86°C，对应于无铁和全铁饱和状态（Xia等人，2023）。除了结构稳定性外，铁饱和度还决定了功能特性，尤其是抗菌活性，这主要取决于铁的缺乏以限制细菌获取这种必需的微量营养素。无铁LF表现出强烈的抗菌活性，但随着LF铁饱和度的增加，这种活性减弱（Farnaud和Evans，2003）。例如，无铁BLF能够强烈抑制荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）和丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae）的生长，而全铁饱和BLF仅表现出弱抑制作用（Wang等人，2013）。同样，无铁和天然状态的LF能显著抑制大肠杆菌K88（Escherichia coli K88）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的生长，而全铁饱和LF则没有这种抑制作用，且铁补充会降低无铁LF对大肠杆菌K88的抗菌活性（Wang等人，2022）。除了抗菌作用外，铁饱和度还调节其他生物功能；无铁LF可抑制氧化应激，从而缓解神经退行性疾病并调节免疫反应，而全铁饱和LF主要参与铁的代谢和运输，影响肿瘤细胞的增殖和系统铁的吸收（Huang等人，2025）。

由于LF具有多种生物活性，它在食品工业中作为功能性成分受到了广泛关注。然而，食品通常需要经过热处理以灭活病原菌和腐败微生物以及内源性和外源性酶。典型的商业热处理包括低温长时间（LTLT，63-65°C，30分钟）和高温短时间（HTST，72-75°C，15-20秒）巴氏杀菌、超高温（UHT，135-145°C，1-10秒）处理以及高压灭菌（RS，115-120°C，10-30分钟）。这些处理也会改变LF的物理化学性质，从而影响其生物功能。例如，在72-95°C下加热15秒会导致LF发生不可逆的结构和物理化学变化（Goulding等人，2021），而LTLT（62.8°C/30分钟）和HTST（72.5°C/15秒）处理不会影响牛乳铁蛋白（BLF）对大肠杆菌O157:H7、沙门氏菌肠炎亚种（Salmonella enteritidis）和单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）的抗菌活性（Conesa等人，2010）。相比之下，65°C加热30分钟、72°C加热10分钟、85°C加热10分钟和95°C加热10分钟会导致LF的二级结构和表面疏水性改变，并丧失成骨活性（Fan等人，2019）。

LF的热诱导变性和聚集受多种因素影响，如铁饱和度。在80°C下加热5分钟会导致全铁饱和LF形成可溶性聚合物，而无铁和天然状态的LF会聚集成大的不溶性复合物（Brisson等人，2007）。最近，Wang等人（2024）研究表明，在72-95°C下加热15秒会导致4-40%铁饱和度的LF发生不可逆的结构和功能变化，且饱和度越高，变化幅度越小，因此铁饱和度超过15%的样品更具抵抗力。这些发现表明，铁饱和度的增加提高了LF的热稳定性。迄今为止，大多数研究仅关注铁饱和度对牛乳铁蛋白（BLF）热稳定性和生物活性的影响，但对于山羊乳铁蛋白（CLF）和羊乳铁蛋白（OLF）的了解较少，尤其是在不同物种之间铁饱和度对热稳定性和抗菌效果的影响方面。

山羊奶和羊奶也广泛用于乳制品中，包括婴儿配方奶粉。由于动物乳中的LF含量低于人类乳中的含量，LF被认为是婴儿配方奶粉中的关键免疫蛋白之一。国家市场监督管理总局（SAMR）要求标有特定动物来源的婴儿配方奶粉使用乳蛋白成分，包括强化LF。因此，了解CLF和OLF的稳定性有助于在加工过程中更好地保持其生物活性。本研究的目的是探讨铁饱和度对BLF、CLF和OLF在热处理前后的物理化学性质和抗菌活性的影响。由于我们之前的研究表明，BLF、CLF和OLF的天然形式在大约65°C和85°C时表现出两个不同的吸热转变（Xia等人，2023），因此本研究中选择了这三个代表性温度（65°C、75°C和85°C）下加热10分钟。根据我们之前的研究（Xia等人，2023），制备了不同铁饱和度的LF样品，然后对其进行热处理，以研究热诱导的聚集、结构变化和抗菌活性。本研究的结果为优化LF来源和铁饱和度水平提供了见解，以更好地保持结构稳定性和抗菌生物活性。

材料

牛乳来自中国江苏的天子乳业有限公司，山羊乳来自中国杭州的云泉月牧场，羊乳来自中国内蒙古的蒙天兰牧场。所有乳样均为成熟乳。CM-Sepharose Fast Flow阳离子交换树脂和Sephacryl S-100 HR凝胶过滤树脂购自中国北京的盈莱科科技有限公司。

细菌菌株包括单核细胞增生李斯特菌CICC 21639（Listeria monocytogenes）和大肠杆菌（Escherichia coli）

浊度分析

随着加热温度的升高（65°C、75°C和85°C，各加热10分钟），LF的浊度逐渐增加（图1）。在相同的加热条件下，铁饱和度越高，LF的浊度增加幅度越小。然而，不同铁饱和度的LF之间增加的程度有所不同。例如，无铁LF在75°C加热时的浊度显著增加（图1A），而天然状态的LF的浊度增加幅度较小

讨论

本研究探讨了铁饱和度对热处理前后BLF、CLF和OLF的物理化学性质和抗菌活性的影响。这些发现为优化LF来源和食品应用中的加工条件提供了有价值的见解。

结论

总之，铁饱和度显著提高了LF的热稳定性，全铁饱和LF对热诱导的聚集和结构变化最为抵抗。然而，铁饱和度的增加导致抗菌活性降低，全铁饱和LF没有表现出抑制作用。相比之下，无铁和天然状态的LF虽然热稳定性较低，但仍保留了抗菌活性，但随加热温度的升高而减弱。此外，还观察到了物种间的差异。

作者贡献声明

周鹏：撰写 – 审稿与编辑，监督，资金获取。吉莉安·科尼什：撰写 – 审稿与编辑，概念构思。汤姆·胡珀茨：撰写 – 审稿与编辑，概念构思。夏思全：撰写 – 审稿与编辑，方法学，数据分析，数据管理。托尔迪·盖尔盖利：撰写 – 审稿与编辑，概念构思。余宇：撰写 – 原稿撰写，方法学，实验设计，数据分析，数据管理，概念构思。张琳娜：撰写 – 审稿与编辑，

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本研究得到了中国国家重点研发计划（2022YFD2101504）和中央高校基本科研业务费（JUSRP202416004）的支持。