通过联合途径工程和解除反馈抑制来增强大肠杆菌中的L-天冬氨酸生物合成

《Food Bioscience》：Enhancing L-Aspartate Biosynthesis in Escherichia coli through Combined Pathway Engineering and Release of Feedback Inhibition

代谢工程改造大肠杆菌实现L-天冬氨酸高效合成，通过增强PEP-OAA-ASP途径、敲除竞争途径基因、引入Bacillus subtilis的rocG基因和计算机辅助设计的PEPC D543I突变体，结合优化发酵条件与细胞密度调控，最终在5L生物反应器中达到12.8g/L的产量。

　　

王道斌|穆桐|杨静文|倪欣然|程喜尧|刘继东|林颖|李宁

广西大学轻工与食品工程学院，中国南宁大学东路100号，530004

摘要

< />Escherichia coli）菌株。通过过表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（ppc）和L-天冬氨酸氨基转移酶（aspC），将碳流重新导向L-天冬氨酸的合成；同时删除pykA、pykF、mdh和aspA基因，减少了丙酮酸和草酰乙酸向其他竞争途径的转化，从而实现了0.24克/升的L-天冬氨酸产量。引入来自枯草芽孢杆菌的L-谷氨酸脱氢酶（rocG）基因后，增强了氨基的供应并提高了草酰乙酸的可用性，使产量提升至0.9克/升。进一步优化葡萄糖的摄取途径并减弱三羧酸循环（TCA循环）的活性，减少了副产物（如乙酸和琥珀酸）的生成，最终产量达到1.47克/升。我们发现细胞密度是影响L-天冬氨酸生物合成的关键因素，通过全细胞转化策略，产量进一步提升至9.1克/升。最后，通过计算机辅助设计获得了一种磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶变体（PEPC^D543I），并鉴定出L-天冬氨酸的外排蛋白GltP，有效缓解了反馈抑制。在优化的 fed-batch 培养条件下，该工程菌株在5升生物反应器中的L-天冬氨酸产量达到了12.8克/升。总体而言，本研究表明，通过协调调控草酰乙酸的流向、细胞密度和反馈抑制，可以有效克服大肠杆菌中L-天冬氨酸积累的瓶颈问题，为L-天冬氨酸的生产提供了一种有前景的策略。

引言

平台化合物因其高度的合成灵活性和能够转化为多种高价值化合物的潜力，在生物质转化和化学制造中得到广泛应用（Becker等人，2015；Choi等人，2015）。L-天冬氨酸是一种蛋白质生成氨基酸，也是合成多种化学品的重要平台化合物，包括L-天冬氨酸家族氨基酸、氨基-γ-丁内酯和2-氨基-1,4-丁二醇，这些化合物在制药、食品和化工行业中有着广泛的应用（Li等人，2017）。目前，工业上L-天冬氨酸的生产主要依赖于固定化天冬氨酸酶（AspA，EC 4.3.1.1）或表达AspA的微生物细胞催化富马酸与氨的反应（Cárdenas-Fernández等人，2012；Patel等人，2016）。然而，富马酸通常来源于石油化工原料，这引发了关于可持续性的担忧。相比之下，使用可再生碳源的微生物发酵提供了一种更环保、更可持续的替代方案（Sharma等人，2024）。此外，微生物细胞工厂可以被改造用于合成L-天冬氨酸衍生物，进一步强化了L-天冬氨酸作为连接可再生原料与高附加值产品的桥梁作用。因此，建立L-天冬氨酸的微生物生物合成系统对于实现其绿色和可持续的工业生产具有重要意义。

大肠杆菌和谷氨酸棒状杆菌已被广泛用作生产L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-谷氨酸、L-丝氨酸和L-组氨酸等氨基酸的工业宿主（D'Este等人，2018；Schwentner等人，2019；Wendisch，2020）。尽管有研究表明谷氨酸棒状杆菌在发酵过程中可以积累L-天冬氨酸及其衍生物β-丙氨酸（Ziert，2014），但大肠杆菌具有成熟的遗传工程工具、快速生长能力和良好的代谢网络，使其成为代谢工程的有吸引力的底盘。尽管如此，目前尚无研究直接证明大肠杆菌能够通过发酵生产L-天冬氨酸。现有的研究主要集中在从葡萄糖开始的全细胞催化上（Piao等人，2019）。虽然有许多研究对大肠杆菌进行了L-天冬氨酸衍生物的生产改造，但只有少数研究旨在实现L-天冬氨酸本身的细胞内积累（Kim等人，2018；Li等人，2016；Song等人，2015；Vo & Park，2022）。

在大肠杆菌中，L-天冬氨酸通过两条主要途径合成（图1）。第一条途径中，糖酵解产生的丙酮酸脱羧生成乙酰辅酶A（acetyl-CoA），随后进入三羧酸（TCA）循环生成富马酸，再经AspA催化胺化生成L-天冬氨酸。第二条途径中，磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）被磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC，EC 4.1.1.31）羧基化为草酰乙酸（OAA），然后利用L-谷氨酸作为氨基供体由AspC转化为L-天冬氨酸。先前的研究表明，平衡AspA和AspC的途径并调节细胞内的氧化还原状态可以增强下游产物（如L-高丝氨酸）的合成（Chen等人，2024）。尽管Piao等人仅通过AspC途径实现了L-天冬氨酸的积累，但β-丙氨酸的产量超过了L-天冬氨酸，并且该策略依赖于全细胞转化而非发酵（Piao等人，2019）。现有研究表明，L-天冬氨酸的细胞内积累比其衍生物更难实现，可能是由于其合成途径中的细胞毒性或反馈抑制。尽管如此，关于L-天冬氨酸积累及其反馈抑制的研究仍然不足。

在这项研究中，我们开发了一种能够通过发酵直接积累L-天冬氨酸的代谢工程大肠杆菌菌株，并系统研究了细胞密度在L-天冬氨酸生物合成中的作用。为了缓解反馈抑制，我们进一步鉴定了一种PEPC突变体和有效的L-天冬氨酸外排蛋白。首先增强了AspC途径中的关键反应，同时减少了PEP向TCA循环的转化。通过阻止丙酮酸进入TCA循环并将碳流重新导向OAA的形成，提高了OAA的合成效率。为了提高L-谷氨酸的可用性，增强了L-谷氨酸脱氢酶（GDH）的表达，促进α-酮戊二酸向L-谷氨酸的转化。此外，对天然磷酸转移酶系统（PTS）进行了改造，以提高PEP的可用性并减少丙酮酸的副产物生成。随后系统评估了不同细胞密度对L-天冬氨酸产量的影响，结果表明细胞密度是生物转化效率的关键决定因素。此外，通过计算机辅助设计和定点突变获得了一系列PEPC突变体，并在工程菌株中过表达了多种内源性氨基酸转运蛋白。这一筛选旨在鉴定能够促进L-天冬氨酸外排的特定转运蛋白，从而缓解其积累对合成途径的反馈抑制。总体而言，本研究不仅为大肠杆菌中L-天冬氨酸的可持续工业生产奠定了坚实基础，还提供了一个可适用于相关生化物质生产的代谢工程框架。

实验部分

化学试剂

DNA聚合酶和DNA连接试剂盒购自Vazyme Biotech Co., Ltd.（中国南京）。氨基酸（L-天冬氨酸、L-丙氨酸）和有机酸（甲酸、乙酸、乳酸、琥珀酸）购自Macklin Biochemical Co., Ltd.（中国上海）。感受态细胞制备试剂盒及其他所有化学试剂均购自Sangon Biotech Co., Ltd.（中国上海）。使用该试剂盒制备的感受态细胞可在-80°C下保存6个月。

初始PEP-OAA-ASP途径的构建

先前的研究表明，工程改造的大肠杆菌菌株能够合成并高效积累L-天冬氨酸的下游衍生物（Hong等人，2014；Zhang等人，2021b）。然而，野生型大肠杆菌无法积累可检测水平的L-天冬氨酸。OAA是L-天冬氨酸生物合成的关键前体，而PEPC催化的异化反应是OAA形成的主要途径（Somasundaram等人，2020）。因此，在本研究中，我们优化了...

结论

在本研究中，通过对多个代谢节点进行靶向改造，大肠杆菌被工程化以实现L-天冬氨酸的直接发酵生产。主要策略包括：（i）增强PEP-OAA-ASP生物合成途径并减少TCA循环中的竞争性代谢流；（ii）进一步优化参与OAA合成和消耗的基因，从而实现细胞内OAA的积累并克服之前的生产瓶颈。

CRediT作者贡献声明

刘继东：撰写 – 审稿与编辑、监督、资源提供、概念构思。倪欣然：监督、软件使用、方法学设计、数据分析。程喜尧：撰写 – 审稿与编辑、数据可视化、监督、资源提供、概念构思。穆桐：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、监督、软件使用、方法学设计、实验研究、数据分析、数据整理、概念构思。杨静文：结果验证、软件使用、方法学设计、数据分析。王道斌：撰写 –

注释

作者声明没有利益冲突。

资助

本研究得到了国家自然科学基金（编号22468009）、广西壮族自治区自然科学基金（编号2024GXNSFAA010508、2025GXNSFBA069456）、2024年广西壮族自治区首批青年人才培养计划以及广西研究生教育创新项目（编号YCSW2025012）的支持。

利益冲突声明

不存在需要声明的利益冲突。