通过计算机模拟发现了一种新型的羊乳清蛋白衍生的抗菌肽：其抗菌活性、作用机制及应用

《Food Bioscience》：In silico discovery of a novel sheep whey protein-derived antimicrobial peptide: antimicrobial activity, mechanism of action, and application

羊乳清蛋白经四种蛋白酶水解后，中性蛋白酶水解产物显示最强抗菌活性。通过超滤离心和液相色谱-串联质谱技术鉴定出394条多肽序列，结合生物信息学分析、机器学习和AlphaFold3预测，筛选出三个候选肽（LKAWSVARLSQKFPKA、TLSQLTKLGKPFK、KKQTALVELLKHKPK）。分子动力学模拟和gmx_mmpbsa计算表明LKAWSVARLSQKFPKA具有最佳膜结合能力和稳定的α螺旋结构，湿实验验证其能有效抑制金黄色葡萄球菌和大肠杆菌，且低溶血毒性，在羊乳中抑菌浓度分别为32 μg/mL和128 μg/mL。该研究为羊乳清蛋白的高值化利用和新型乳源抗菌肽开发奠定理论基础。

　　

帅奇吉|孟雪楼|费玉安|一琳周|一朱|国嘉伟|墨超罗|陶伟张|文倩李|新意张|瑞娜吴|俊瑞吴

沈阳农业大学食品科学学院，中国沈阳110866

摘要

羊乳清蛋白是一种用于生产生物活性肽的宝贵资源，但由于容易受到污染或经常被丢弃，导致资源浪费。本研究通过评估四种蛋白酶水解羊乳清蛋白的抗菌效果，探索了新型的牛奶衍生抗菌肽（AMPs）在羊奶保鲜中的应用。研究采用了单因素实验和响应面方法，并结合计算机模拟和湿实验验证。结果表明，中性蛋白酶水解产物具有最强的抗菌活性。随后，通过超滤离心和液相色谱-串联质谱法从中性蛋白酶水解产物的1–3 kDa组分中鉴定出394种肽序列。通过多种生物信息学分析、机器学习和AlphaFold3软件，筛选出三种候选肽——LKAWSVARLSQKFPKA、TLSQLTKLGKPFK和KKQTALVELLKHKPK——进行进一步研究。200纳秒分子动力学模拟和gmx_mmpbsa计算显示，LKAWSVARLSQKFPKA在金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和大肠杆菌（Escherichia coli）环境中表现出更强的膜结合能力和稳定的α-螺旋结构。湿实验表明，该肽能够破坏细菌膜并导致细胞内物质泄漏，显示出对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的优异抗菌活性和稳定性，同时具有较低的溶血毒性。此外，LKAWSVARLSQKFPKA在最低抑制浓度分别为32 μg/mL和128 μg/mL时，能有效抑制羊奶中的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌生长。总体而言，这些发现为羊乳清蛋白的应用和新型牛奶衍生抗菌肽的开发提供了理论基础。

引言

羊奶具有独特的营养成分和健康益处。随着消费者对更健康、更天然的牛奶替代品需求的增加，羊奶制品的加工变得越来越普遍（Ramirez-Diaz等，2025；Zhang等，2024）。然而，包括羊奶在内的乳制品容易受到金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和大肠杆菌（Escherichia coli）等食源性病原体的污染。金黄色葡萄球菌能产生耐热毒素，引起食物中毒，而大肠杆菌主要导致食源性疾病。如果在加工、储存和运输过程中缺乏有效的控制措施，这些病原体会影响最终产品的安全性并对消费者构成健康风险。抗菌肽（AMPs）作为天然防腐剂具有巨大潜力。它们是分子量小于5 kDa的生物活性肽，通常带有正电荷，具有α-螺旋或β-折叠结构，并具有中等疏水性，能够破坏微生物膜并发挥抗菌作用（Ji等，2024）。尽管天然抗菌肽如尼辛已被用作食品防腐剂，但它们对革兰氏阴性菌的效果有限，限制了其应用（Lanza等，2025）。因此，开发新型抗菌肽可以提高羊奶制品的安全性并延长保质期，从而确保食品安全。

羊乳清蛋白由α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、血清白蛋白、免疫球蛋白和乳铁蛋白组成，约占羊奶总蛋白含量的20%（Scano等，2025）。除了富含必需氨基酸外，乳清蛋白还是多种具有抗氧化、抗菌、抗高血压、抗糖尿病和免疫调节特性的生物活性肽的前体（Ren等，2025）。然而，乳清蛋白常常作为乳制品加工的副产品被丢弃。在奶酪和酸奶生产过程中，乳清通常与洗涤水混合后被丢弃，导致资源浪费和环境影响。因此，合理利用乳清蛋白受到了重视。先前的研究已经探索了通过酶法水解乳清蛋白来鉴定新型抗菌肽。Czelej等（2025）使用胃蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶水解牛乳清蛋白，并成功鉴定出多种新型抗菌肽。类似地，Mudgil等（2022）水解了骆驼乳清蛋白、牛乳清蛋白和酪蛋白，发现了对致病性念珠菌（Candida）具有强抑制作用的新型抗菌肽。其他类型的乳清蛋白也被广泛用于生物活性肽的研究（Krunic & Rakin，2025）。然而，羊乳清蛋白作为原料的潜力尚未得到充分开发。因此，本研究探索了新型羊奶衍生抗菌肽，以提升这一未充分利用资源的价值并减少羊奶中的微生物污染。

近年来，生物信息学工具被广泛用于预测生物活性肽的活性。结合计算机模拟（in silico）和湿实验的方法有效提高了生物活性肽筛选的效率和准确性。计算机模拟利用计算模拟、机器学习（ML）预测和生物信息学分析来预测生物活性肽的序列并评估其潜在的生物活性（Ji等，2025；Lou等，2025）。湿实验进一步验证了计算机模拟方法预测的结果，确认了新型生物活性肽的活性、稳定性和安全性。这两种方法的结合大大加速了新型生物活性肽的发现。Alahyaribeik等（2025）使用分子对接技术模拟了酵母来源的肽与DPP-IV酶之间的相互作用，并通过抑制实验和细胞渗透性测试进一步揭示了VW9及其衍生肽在功能性食品开发中的潜力。Cui等（2025）使用分子模拟方法对环状鲜味肽进行了建模，并通过与鲜味受体的对接分析探讨了环化对其性质的影响。感官评估证实了环状肽的鲜味增强效果，分子模拟和感官评估的结合为环状鲜味肽的设计提供了理论指导。Wang等（2025）使用深度学习和分子动力学（MD）等计算机模拟方法筛选抗菌肽，并通过湿实验验证了它们的抗菌效果。抗菌肽的高效率证明了结合计算机模拟和湿实验方法在发现新型抗菌肽方面的可靠性。在本实验中，我们也通过计算机模拟和湿实验相结合的方法从酶水解的羊乳清蛋白中成功鉴定出新型抗菌肽，证实了它们的强抗菌效果和应用潜力。本研究为常见副产品的的高价值利用提供了一种新方法，并为开发基于乳制品肽的生物基防腐剂提供了理论基础。

实验材料

从中国上海获得的羊乳清蛋白在-80°C下储存，最长储存时间为2个月。中性蛋白酶（100 U/mg）、木瓜蛋白酶（800 U/mg）、胃蛋白酶（3000 U/mg）和胰蛋白酶（250 U/mg）购自上海源业生物科技有限公司，每种酶的储存时间最长为12个月。去纤维化羊血来自上海雨多生物科技有限公司，在2°C下储存，最长储存时间为2周。金黄色葡萄球菌（ATCC 25923）和大肠杆菌（ATCC 25922）在-80°C下储存。

未消化乳清蛋白的抗菌活性及用于水解的指示菌株选择

未消化羊乳清蛋白对金黄色葡萄球菌（S. aureus）和大肠杆菌（E. coli）的抗菌活性见表S7。结果表明，天然乳清蛋白没有抑制作用，可能是由于其完整的结构阻碍了与细菌膜的相互作用。四种蛋白酶水解产物对金黄色葡萄球菌的抑制率均超过65%，但对大肠杆菌的抑制率低于10%。值得注意的是，胰蛋白酶水解产物对大肠杆菌没有抑制作用，可能是由于...

结论

本研究通过计算机模拟和湿实验从羊乳清蛋白中鉴定出一种新型抗菌肽LKAWSVARLSQKFPKA。LKAWSVARLSQKFPKA在金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的膜模型中保持了稳定的二级结构，表现出强烈的膜结合亲和力。它有效抑制了羊奶中这两种细菌的生长，从而减少了食源性病原体的污染并提高了奶的安全性。机制研究表明，LKAWSVARLSQKFPKA通过...

作者贡献声明

国嘉伟：方法学、研究。一琳周：方法学、研究、数据管理。一朱：方法学、研究、概念构思。孟雪楼：可视化、方法学、研究、数据分析。费玉安：方法学、研究、数据管理。瑞娜吴：验证、监督、资源管理、项目管理、资金获取。帅奇吉：撰写——审稿与编辑、撰写——初稿、验证、软件应用、方法学、研究。

未引用的参考文献

Tang等，2025；Wang等，2025。

利益冲突

作者声明没有利益冲突。

利益冲突声明

? 作者声明没有已知的可能会影响本文研究的财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（项目编号：32172279）、辽宁振兴人才计划（项目编号：XLYC2213026、XLYC2402005）、辽宁省科技计划项目（项目编号：2024JH2/101900005）、沈阳农业大学高层次人才引进研究启动基金项目（项目编号：2023YJRC002）以及沈阳科技创新平台项目（项目编号：21-103-0-14、21-104-0-28）的支持。