Limosilactobacillus fermentum LF61：从基因组学到临床应用的多维度安全性与功能性研究

《Food and Chemical Toxicology》：Limosilactobacillus fermentum LF61: A Multidimensional Study on Safety and Functionality from Genomics to Clinical Application

本研究系统评估了人乳分离的Limosilactobacillus fermentum LF61菌株的安全性与功能特性，通过基因组分析（无致病基因及耐药基因）、体外耐受实验（胃酸/肠液存活率>98%）及动物毒理测试（LD50>2×101? CFU/kg），证实其符合EFSA QPS安全标准；随机双盲临床试验显示其可显著提升血清LL-37（12.3%）、IgA（18.7%）、IgG（15.2%）和IgM（9.8%）水平，并通过宏基因组学揭示其通过短链脂肪酸代谢激活碳水代谢通路，维持菌群多样性，证实其通过肠-免疫轴双向调节机制发挥免疫增强作用，为新型益生菌开发提供理论依据。

　　

金满飞|徐飞|刘英华|蒋兆

西藏民族大学高原生物医学大数据挖掘与生物信息学分析实验室，中国咸阳，712082

摘要

本研究对从人乳中分离出的Limosilactobacillus fermentum LF61的安全性和功能有效性进行了全面的多维度评估。基因组分析显示，其染色体（2.04 Mb）和质粒（15.5 kb）中不存在毒力因子（VFDB）、耐药基因（CARD）或毒素合成基因簇（antiSMASH），符合欧洲食品安全局（EFSA）的QPS安全标准。体外研究表明，LF61在胃酸（pH 2.0）中的存活率超过98%，在肠液（pH 8.0）中的存活率为99.66%。LF61对Caco-2细胞也无毒性（20%浓度下的代谢活性为100.3 ± 2.1%）。急性口服毒性测试（在ICR小鼠中）显示LD50 >2 × 10¹⁰ CFU/kg。在一项随机双盲临床试验（n = 49）中，每天摄入3×10¹⁰ CFU的LF61 8周后，血清中的抗菌肽LL-37水平增加了12.3%（p < 0.05），IgA、IgG和IgM水平分别增加了18.7%、15.2%和9.8%（p < 0.05）。宏基因组分析表明，LF61促进了产生短链脂肪酸的细菌（如Mitsuokella和Turicibacter）的定植（LDA > 3），激活了碳水化合物代谢途径（p = 0.002），并维持了微生物组的α多样性（Shannon指数p > 0.05）。总体而言，我们的研究结果表明，LF61通过肠道-免疫轴的双向调节机制发挥有益作用，为开发针对肠道-免疫轴的新免疫调节益生菌提供了理论基础和临床证据。

引言

肠道微生物群与宿主免疫系统持续相互作用。这种双向通信通常被称为“肠道-免疫轴”。

近年来，双向调节机制已成为生物医学研究的前沿课题。作为人体最大的免疫器官，肠道相关淋巴组织（GALT）容纳了超过70%的免疫细胞，并通过复杂的“肠道-免疫轴”网络调节全身免疫稳态。（Lynch和Pedersen，2016）研究表明，肠道微生物代谢物（如短链脂肪酸和色氨酸衍生物）直接调节黏膜屏障完整性、免疫细胞分化和炎症信号通路。这些过程的失调与多种慢性疾病密切相关，包括炎症性肠病和代谢综合征（Cantón等人，2024；Thursby和Juge，2017）。因此，旨在调节肠道微生物群组成和功能的益生菌干预已成为促进宿主健康的有希望策略（Koh等人，2016）。

在各种益生菌中，Limosilactobacillus fermentum因其独特的生态适应性和多种益生菌功能而受到广泛关注。该菌种广泛存在于母乳和发酵食品中，表现出优异的耐酸性和耐胆盐性（在pH 2.0下的存活率>80%，对0.3%牛磺胆酸盐具有抗性）（Zommara等人，2023）。值得注意的是，不同菌株具有不同的免疫调节能力，某些菌株通过分泌抗菌肽或调节细胞因子来增强宿主防御（Taverniti和Guglielmetti，2011）。然而，当前研究中仍存在几个关键空白。首先，安全性评估不足，只有16%的研究进行了全基因组筛查以检测毒力因子（Guryanova和Ovchinnikova，2022）。其次，功能验证主要限于体外实验，而随机对照临床试验的比例不到25%（Galipeau等人，2016）。第三，对“微生物-代谢物-免疫”轴的机制理解碎片化，缺乏综合分析（Dang和Marsland，2019）。

同时，全球监管机构对益生菌的安全性提出了越来越严格的要求。联合国粮食及农业组织/世界卫生组织（FAO/WHO）的指南要求对用于食品和膳食补充剂的菌株进行全基因组测序（WGS），以排除毒力基因和可移动的抗生素抗性元件（Roe等人，2022）。欧洲食品安全局（EFSA）引入了合格安全假定（QPS）框架，需要结合基因组分析和体外验证来确认菌株的安全性（Herman等人，2019）。同样，美国食品药品监督管理局（FDA）和中国国家卫生健康委员会（NHC）也发布了技术指南，强调对溶血活性、生物胺生成和其他安全指标的系统性评估（Jeong和Lee，2015）。总体而言，这些发展突显了现代益生菌研究需要建立全面的“基因到功能”证据链。

在这种背景下，本研究聚焦于从母乳中分离出的L. fermentum LF61菌株，采用多维度评估框架。首先，通过全基因组测序全面筛查潜在风险基因。其次，进行了包括胃酸和肠道耐受性测试以及细胞毒性评估在内的体外实验来评估安全性。最后，进行了一项随机双盲临床试验，以检查其对血清免疫标志物（LL-37、免疫球蛋白）和肠道微生物群组成的影响。通过这项系统的研究，我们不仅提供了支持LF61应用的科学证据，还为标准化的益生菌评估提供了方法学参考。

部分摘录

细菌菌株和培养条件

本研究中使用的益生菌菌株Limosilactobacillus fermentum LF61最初是从中国黑龙江省绥化市赵东县刘勤窝蓬村和洪丁村收集的人乳样本中分离出来的。该菌株由Wecare Probiotics有限公司提供，并已存入中国普通微生物菌种保藏中心（CGMCC），保藏编号为CGMCC No.18296。为了确保菌株的遗传特性和稳定性

L. fermentum LF61的基因组特征

Limosilactobacillus fermentum LF61的全基因组已进行测序和组装。结果显示，该菌株包含一个完整的闭合环状染色体，长度为2,035,217 bp（图2A），以及一个长度为15,542 bp的质粒（图2B），总体GC含量约为51.7%。

基因组注释结果显示，LF61携带的主要与细胞代谢、信号转导和应激反应相关的功能基因。

讨论

本研究从基因组学、体外实验到动物实验，系统地评估了从人乳中分离出的Limosilactobacillus fermentum LF61的安全性和功能潜力。首先，基因组分析确认了该菌株不存在毒力因子、抗生素耐药基因或毒素合成簇，完全符合欧洲食品安全局（EFSA）的合格安全假定（QPS）标准

局限性

本研究存在几个局限性。首先，临床试验的样本量相对较小，仅涉及健康的年轻人。虽然这种同质人群有助于减少早期探索性研究中的混杂因素，但限制了研究结果在更广泛或脆弱人群（如儿童、老年人或有基础疾病的人）中的普遍性。未来需要更大规模、参与者群体更多样的临床试验来验证

结论

总之，本研究提供了多层次的综合证据，支持Limosilactobacillus fermentum LF61作为一种安全且功能有前景的益生菌候选者。首先，基因组学、体外和体内评估一致证实了其高安全性，包括不存在风险基因、优异的胃肠道耐受性和较大的安全边际。此外，临床干预表明它能够通过上调关键效应因子（LL-37、IgA）来增强宿主免疫力

CRediT作者贡献声明

刘英华：撰写 – 审稿与编辑。金满飞：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，研究。徐飞：撰写 – 审稿与编辑。蒋兆：撰写 – 审稿与编辑，项目管理

未引用参考文献

Duranti等人，2017；Fuochi等人，2015；中华人民共和国国家卫生健康委员会；Song和Shin，2022；世界医学协会，2002；Zheng等人，2017。

披露声明

作者声明，本研究是在没有任何可能被视为潜在利益冲突的商业或财务关系的情况下进行的。

数据可用性声明

支持本研究结果的数据可在文章中找到。

利益冲突声明

作者声明，他们没有已知的可能会影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。