脉冲电场在分离美味猕猴桃（Actinidia deliciosa）与印度仙人掌（Opuntia ficus-indica）果皮中的酚类化合物方面的选择性研究：采用三重TOF-LC-MS/MS技术进行成分分析以促进其资源化利用

《Food Bioscience》：Pulsed Electric Fields selectivity in peel phenolics from Actinidia deliciosa vs. Opuntia ficus-indica: Triple TOF-LC-MS/MS profiling for valorization

青枯菌素（Que）通过拮抗QS受体抑制铜绿假单胞菌致病性，与D-色氨酸或D-亮氨酸联用可显著增强对游离菌和生物膜的作用，降低存活率达2.19-3.97 log，破坏生物膜基质和细胞膜完整性，协同抑制关键酶活性。

　　

季梦梦|李金伟|范柳萍|王亮|黄胜全

江南大学食品科学与技术学院，中国江苏省无锡市梨湖路1800号，214122

摘要

铜绿假单胞菌是一种重要的机会性病原体，由于其对抗生素的耐药性和强烈的生物膜形成能力，对食品安全构成了严重威胁。在本研究中，发现槲皮素（Que）是一种新型的群体感应（QS）抑制剂。报告菌株实验、分子对接和动态模拟表明，Que能够作为QS受体的拮抗剂。Que以剂量依赖的方式减弱了QS调控的毒力表型，但在低于最小抑制浓度（sub-MIC）的水平下，其抗菌生物膜活性不足（p>0.05）。相比之下，0.5 mmol/L的Que与20 mmol/L的D-亮氨酸或D-色氨酸联合使用对浮游细胞表现出叠加效应，使其存活率降低了2.19–3.97 log。对于生物膜细胞，联合处理使细胞密度降低了0.48–1.42 log。值得注意的是，这些效应依赖于菌株，但与ε-聚赖氨酸（ε-PL）对照组的效果相当或更优。其机制是通过破坏生物膜基质和细胞膜完整性来实现的。这一点通过抑制酰基高丝氨酸内酯（AHLs）的合成和毒力表型，以及显著降低生物膜生物量和粗糙度并增加膜通透性得到证实。此外，这种联合处理还使关键酶活性（Na⁺-K⁺-ATP酶和琥珀酸脱氢酶）降低了29%–38%。这些变化表明这是一种控制铜绿假单胞菌并提升食品安全的有希望的策略。

引言

肉类及其加工环境为微生物生长提供了理想的条件，尤其是铜绿假单胞菌，这种细菌既是常见的腐败菌也是机会性病原体（Miller & Arias, 2024; Tian et al., 2025）。在牛肉、羊肉、鸡肉和猪肉等多种肉类中都检测到了铜绿假单胞菌，其检出率范围为6.57%至42.1%（Jawher et al., 2022; Poursina et al., 2023; Wu et al., 2023）。这种病原体可以释放破坏食品质量的毒力因子，并形成对化学防腐剂和消毒剂具有强抵抗力的生物膜（Ciofu et al., 2022）。附着在各种表面的生物膜细菌难以清除，这会在禽肉、乳制品、即食食品和水产养殖等食品行业中引发交叉污染问题（Rather et al., 2021a; Cho et al., 2024）。

越来越多的天然生物活性化合物被认定为安全（GRAS），并重新受到关注，用于替代化学防腐剂来控制铜绿假单胞菌，包括植物提取物或植物基纳米颗粒、抗菌肽（AMPs）以及来自动物或微生物的酶（Rather et al., 2021b; Rather and Mandal, 2023; He et al., 2022; Cho et al., 2024; Tian et al., 2025）。然而，由于潜在的致敏性、蛋白酶敏感性、高成本和细胞毒性，AMPs或酶在肉类保鲜中的应用受到限制（Zhang et al., 2021; Cho et al., 2024）。当前的研究表明，铜绿假单胞菌的某些表型，如毒力因子（蛋白酶、脂肪酶）的分泌、对抗生素的耐药性和生物膜积累，都是通过群体感应系统（QS）根据种群密度进行调节的（Yang et al., 2021; Rather et al., 2022）。多酚（PP）是一类广泛研究的植物化学物质，是QS抑制剂的主要来源（Shamsudin et al., 2022; Ivanov et al., 2022; Lima et al., 2025）。研究表明，多酚具有抗QS作用，可以影响铜绿假单胞菌的致病性和次级代谢产物的产生，减少毒力因子的产生和生物膜的形成（Wang et al., 2021; Zeng et al., 2024; Huang et al., 2025）。此外，多酚还具有多种抗菌机制，包括破坏细胞膜完整性、干扰QS通路和抑制铜绿假单胞菌的繁殖（Liu et al. 2025; Akter et al., 2025; Wang et al., 2025）。槲皮素是一种黄色黄酮类化合物，因其作为治疗剂和食品防腐剂的潜力而特别受到关注，尽管其抗菌和抗QS效果尚未得到充分研究（Zhang et al., 2025）。

鉴于抗菌耐药性的出现，使用多酚作为QS抑制剂的联合疗法成为一种有前景的策略。在联合疗法中，多酚可以通过减少QS信号分子和毒力因子来减弱铜绿假单胞菌的致病性，从而增强杀菌效果（Lu et al., 2025; Tian et al., 2025）。此外，D-氨基酸（D-AAs）提供了一种无毒且生物相容的生物膜分散方法，以及有效的防腐剂来控制腐败的铜绿假单胞菌（Brandenburg et al., 2013; Chen et al., 2022）。研究表明，D-氨基酸可以增强肉豆蔻精油、银和植物化学纳米颗粒的抗菌生物膜效果（Cui et al., 2017; Huang et al., 2020; Pourhajibagher et al., 2023）。尽管D-氨基酸和多酚的组合可能是对抗铜绿假单胞菌的有效策略，但相关系统研究仍有限，特别是在结构变异、浓度比和菌株特异性方面。此外，关于它们联合机制的研究也缺乏。

为了解决这一不足，本研究提出了一种将多酚与D-氨基酸结合的新策略。首先，使用lacZ报告菌株和分子对接技术评估了多酚的QS抑制效果。其次，评估了D-Trp和D-Leu与槲皮素（Que）联合使用对铜绿假单胞菌的疗效。最后，研究了这些组合的潜在机制。本研究旨在开发一种安全有效的策略，以控制铜绿假单胞菌污染和相关的生物膜风险，从而提高食品安全。

材料与试剂

测试的45种多酚列于表1中。所有化合物的纯度均≥98%，购自上海世丰生物科技有限公司。八种D-氨基酸（D-Leu、D-Trp、D-Pro、D-Phe、D-Cys、D-Lys、D-Met、D-Tyr）和ε-PL购自上海阿拉丁生物科技有限公司。碘化丙啶（PI）、瑞金红、2-庚基-3-羟基喹啉-4(1H)-酮（PQS）和3-氧代-C12-HSL购自上海贝泰生物科技有限公司。Luria-Bertani培养基（LB）等试剂也用于实验。

活性多酚的最低抑制浓度（MICs）

多酚的抗菌效果受其类型和浓度的影响。在来自四个主要类别（黄酮类、酚酸、木脂素和姜黄素类）的45种多酚中，筛选出了对铜绿假单胞菌 PAO1具有抗菌作用的多酚。表1显示，24种多酚抑制了PAO1的生长，并根据MIC值将其分为六组：Group1（39.0625 mg/L < MIC ≤ 78.125）

结论

总之，本研究确定槲皮素（Que）是LasR和PqsR受体的强效拮抗剂，分子动力学模拟证实了其在结合口袋内的稳定性。Que在低于抑制浓度下有效抑制了LasB弹性酶活性、鼠李糖脂的产生和铜绿假单胞菌蓝菌素的合成。关键的是，Que（0.5 mmol/L）与D-氨基酸（D-Trp或D-Leu，20 mmol/L）的联合使用克服了单独治疗的局限性。

CRediT作者贡献声明

季梦梦：撰写——原始草稿、方法学、数据整理。范柳萍：撰写——审阅与编辑、验证、监督、概念构思。李金伟：撰写——审阅与编辑、方法学。黄胜全：撰写——审阅与编辑、方法学。王亮：撰写——审阅与编辑、方法学

未引用的参考文献

Jawher and Hassan, 2022; Shastry and Abhinand, 2024.

利益冲突

作者确认他们与本手稿所述的工作没有利益冲突。

利益冲突声明

? 作者声明他们没有已知的利益冲突或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本研究得到了中国新疆自治区关键研究与发展计划（2025B04020-003）和中国内蒙古技术振兴项目（2025KJTW02）的资助。