《Food Chemistry: X》：Molecular basis of trypsin's autolysis resistance acetylation for sustained enzymatic activity
编辑推荐：
本研究针对胰蛋白酶易自溶失活的技术瓶颈，通过分子动力学模拟与生化实验相结合，揭示了乙酰化修饰通过变构效应增强酶结构稳定性（RMSD降低0.03 nm）并诱导活性位点精细重构的分子机制。实验证实乙酰化胰蛋白酶在6小时自溶后活性保留率达80.78%（天然酶为54.2%），为食品酶工程中蛋白酶理性设计提供了原子层面理论依据。
胰蛋白酶作为一种广泛用于食品工业的丝氨酸蛋白酶，其高效催化特性与高度特异性使其在婴儿配方奶粉、营养保健品等蛋白质水解过程中不可或缺。然而，这种酶存在一个致命缺陷——自溶现象。当胰蛋白酶在催化过程中接触到自身特定肽键时，会发生自我降解，导致酶活性迅速丧失。这一特性严重限制了其在需要长时间反应的工业场景中的应用。传统解决方案如PEG化修饰或固定化技术虽能一定程度缓解自溶，但往往以显著降低催化效率为代价。因此，探索既能保持酶活性又能增强稳定性的新策略成为该领域的研究热点。
发表于《Food Chemistry: X》的这项研究创新性地聚焦于翻译后修饰中的乙酰化技术。研究人员通过整合计算模拟与实验验证，系统阐述了乙酰化修饰调控胰蛋白酶功能的双面性机制。为开展研究，团队首先利用大肠杆菌表达系统制备重组人胰蛋白酶，通过镍柱亲和层析与分子筛层析获得高纯度酶制剂。乙酰化修饰采用乙酸酐化学法实现，并通过MALDI-TOF质谱验证修饰效率。酶学特性分析采用BAEE（N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯）底物法监测253 nm波长吸光度变化，自溶稳定性实验通过SDS-PAGE电泳与活性保留率评估。分子层面机制探索结合了AlphaFold3结构预测、AutoDock Vina分子对接以及GROMACS软件的100 ns分子动力学模拟，重点分析RMSD（均方根偏差）、RMSF（均方根涨落）、Rg（回转半径）等关键参数。
3.1 胰蛋白酶在易自溶催化区域呈现高灵活性
通过100 ns分子动力学模拟发现，天然胰蛋白酶整体结构稳定（RMSD<0.1 nm），但其三个环状区域（72-86、120-136、193-205位残基）表现出显著动态波动。这些区域恰好包含已知的自溶热点位点（Lys9、Arg69、Arg134、Arg202），特别是位于活性位点环上的Arg134和Arg202因高可动性更易被催化中心切割。
3.2 乙酰化对胰蛋白酶结构和动力学的影响
乙酰化引入导致全局稳定性提升（RMSD降低0.03 nm），但伴随结构扩张（Rg增加0.01 nm）和局部灵活性增强。关键发现是乙酰化虽未改变整体折叠，却通过破坏盐桥网络（数量从14个减至8个）诱导变构效应，使催化三联体（His40、Asp84、Ser177）间距缩短，活性位点几何构象发生畸变。
3.3 乙酰化以适度活性降低为代价增强胰蛋白酶自溶抗性
实验证实乙酰化酶在37°C处理6小时后活性保留率达80.78%，显著高于天然酶的54.2%。尽管初始活性降低23.2%，但修饰后酶的自溶降解明显减缓。圆二色谱显示乙酰化未破坏二级结构，尺寸排阻色谱中保留体积前移（97.7 mL→91.3 mL）提示构象扩张。
3.4 分子对接分析胰蛋白酶与乙酰化酶底物结合差异
对接结果表明乙酰化使BAEE结合能从-6.981 kcal/mol升至-6.576 kcal/mol。关键变化是底物与催化残基His40、Ser177的氢键数量从3个减至2个，结合模式转向更多疏水相互作用，导致底物定位精度下降。
3.5 分子动力学揭示乙酰化酶-底物复合物的变构重构状态
模拟发现乙酰化酶-底物复合物呈现更显著的构象涨落，特别是修饰位点周边区域。最关键的机制是催化中心形成非天然的His40-Asp84相互作用，扭曲了质子转移通道，从原子层面解释活性降低现象。
本研究首次从原子尺度阐明了乙酰化调控胰蛋白酶功能的双刃剑效应：通过变构传播实现结构稳定化与活性位点重构的平衡。这种"稳定化但低效"的酶状态为食品工业中蛋白酶定制化设计提供了新范式——通过精准调控翻译后修饰位点，可理性平衡酶稳定性与催化效率的矛盾需求。该机制不仅适用于胰蛋白酶家族，也为其他工业用酶的理性改造提供了理论框架，特别是在需要长时间酶反应的食品加工场景中具有广阔应用前景。
