气候适应性白羽扇豆（Lupinus albus）蛋白分离物的结构-功能特性及蛋白质质量：深度共晶溶剂与传统蛋白质提取方法的影响

《Food Hydrocolloids》：Structure-functional properties and protein quality of climate-smart white lupin ( Lupinus albus) protein isolates: Impact of deep eutectic solvent and conventional protein extraction methods

菜豆蛋白通过胆碱盐-甘油深共熔溶剂（DES）绿色提取工艺优化，获得88.42%高纯度蛋白，其α-螺旋（24.16%）和β-折叠（66.08%）含量优于碱性提取法，且功能特性更优，适用于可持续蛋白生产。

　　

哈沙尼·纳迪沙尼（Harshani Nadeeshani）|阿努鲁迪卡·赫瓦奇（Anuruddika Hewage）|赵宇（Yu Zhao）|阿曼达·G.A. 萨（Amanda G.A. Sá）|詹姆斯·D·豪斯（James D. House）|南迪卡·班达拉（Nandika Bandara）

加拿大曼尼托巴大学农业与食品科学学院食品与人类营养科学系，温尼伯，曼尼托巴省，R3T 2N2

摘要

由于羽扇豆的物种多样性、蛋白质含量和组成以及对气候压力的耐受性，它成为蛋白质工业的一个有前景的替代品。因此，本研究旨在使用一种绿色且可持续的深共晶溶剂（DES）系统（由氯化胆碱和甘油组成）从羽扇豆中提取高纯度和高功能的蛋白质。通过响应面方法优化了蛋白质提取条件，并对提取的蛋白质进行了物理化学、功能性和蛋白质质量参数的表征，以与碱性提取的蛋白质分离物进行比较。基于DES的蛋白质提取的最佳条件为固液比1:17.5（w/w）、反应时间60分钟以及水分含量54%（w/w）。在最佳条件下，蛋白质含量、蛋白质产量和蛋白质回收率分别为88.42±0.09%、64.47±0.56%和23.76±0.21%。碱性提取虽然蛋白质含量较高，但产量和回收率较低（P<0.05）。根据二级结构分析，DES提取的蛋白质中的α-螺旋（24.16%）和β-折叠（66.08%）含量高于碱性提取的蛋白质。而分子间的β-折叠（12.51%）仅存在于碱性提取的蛋白质中，这表明碱性提取的蛋白质发生了更多的聚集和变性。DES提取的蛋白质与碱性提取的蛋白质在功能性方面相似或有所提高（P<0.05）。此外，DES提取的蛋白质还表现出显著的凝胶化特性。体外蛋白质消化率（IVPD）在两种蛋白质分离物之间没有显著差异（P<0.05），均为90.8–91.8%。DES提取的蛋白质含有比碱性提取的蛋白质更高的硫氨基酸含量。DES提取技术是一种有前景的方法，可以作为传统碱性提取的替代方法，用于生产可持续且高纯度的白色羽扇豆蛋白质成分。

引言

对于具有与动物蛋白相当的营养价值和功能性的绿色、可持续且价格合理的蛋白质来源，市场需求巨大。2024年全球蛋白质成分市场规模估计为526.3亿美元，预计到2033年将达到858.4亿美元，2025年至2033年的年增长率为5.6%（Grand View Research，2025年）。在这种背景下，豆类蛋白已被确定为未来蛋白质供应的可行替代品（Malila等人，2024年）。在不同的豆类中，属于豆科植物的羽扇豆（Lupinus albus）在加拿大逐渐受到更多生产商的关注（Protein Industries Canada，2025年）。此外，由于其多样性、较高的蛋白质含量（35-40%）以及对干旱、极端温度、贫瘠土壤和高盐度等压力因素的较高耐受性，羽扇豆被认为是蛋白质工业的一个有前景的作物（Heinz等人，2024年；Sujak等人，2006年）。全球羽扇豆的总产量为1,644,690吨，并且近年来一直在快速增长（FAOSTAT，2022年）。尽管大豆是种植最广泛的豆类作物，也是全球食品和饲料中植物蛋白的主要来源，但去壳羽扇豆种子的蛋白质含量为39–53%（干基），而大豆的蛋白质含量低于25%（Vogelsang-O’Dwyer等人，2020年），并且羽扇豆的生产成本仅为大豆的一半（Lo等人，2021年）。羽扇豆蛋白的致敏性略低于大豆，致敏率约为4%（B?hr等人，2014年），据报道羽扇豆的过敏反应阈值剂量（19.1毫克）低于大豆（24.5毫克）（Remington等人，2013年）。

羽扇豆主要在西澳大利亚种植，该地区是全球最大的生产地，欧洲也表现出浓厚的兴趣。此外，它们也在南美洲、南非、加拿大和美国等地种植（Vogelsang-O’Dwyer等人，2020年）。羽扇豆是豆科植物中一个高度多样化的属，包含超过400个已知物种。其中，世界上只有四种羽扇豆被栽培，即白色羽扇豆（Lupinus albus）、黄色羽扇豆（L. luteus）、窄叶羽扇豆（L. angustifolius）和珍珠羽扇豆（L. mutabilis）（Mazumder等人，2021年）。羽扇豆蛋白通常由1:9的清蛋白和球蛋白组成，主要蛋白质可以分为α-凝集素（11S）、β-凝集素（7S）、γ-凝集素（7S）和δ-凝集素（2S）（Vogelsang-O’Dwyer等人，2020年）。

选择一种高效且兼容的蛋白质提取方法至关重要，因为它会影响蛋白质的功能性和营养价值，从而影响其在食品配方中的应用（Pan等人，2022年）。目前，食品行业正在寻求并采用更可持续的方法从豆类中提取蛋白质成分，以尽量减少环境影响的同时最大化利润。尽管碱性提取多年来一直是最常用的方法，但它有许多缺点，例如产生大量废水和消耗大量刺激性化学物质（Kumar等人，2021年）。此外，这些化学物质和提取条件主要在碱性提取技术中使用，会导致蛋白质变性，从而影响其技术功能特性（Smith等人，2014年）。然而，基于DES的提取方法可以避免在蛋白质加工过程中使用强酸、碱和传统有机溶剂等对环境有害的化学物质，提供了一种更绿色和可持续的替代方案。研究发现，DES提取对蛋白质变性的影响较小，表明提取的蛋白质在食品系统中可能表现出更好的功能特性（Hewage等人，2024年）。

DES通常由两种或三种廉价且安全的化学成分组成，它们可以通过氢键相互作用形成共晶混合物（Q. Zhang等人，2012年）。大多数情况下，DES是通过将季铵盐与金属盐或能够与季铵盐的卤化物阴离子形成复合物的氢键供体混合得到的。由于存在非对称的大离子且晶格能量低，因此所得溶剂混合物的熔点较低（Smith等人，2014年）。最近的研究表明，使用非环境有害的DES系统（如氯化胆碱（ChCl）-甘油、ChCl-草酸和ChCl-尿素）进行蛋白质提取可以保持蛋白质的功能性并提高提取效率，同时不会导致蛋白质变性（Hewage等人，2024年；Lin等人，2022年；Zhou等人，2022年）。此外，在不同的DES中，ChCl和甘油系统被认为具有高蛋白质产量、生物降解性、低毒性和低成本（Ferreira等人，2021年；Hewage等人，2024年）。

在先前的研究中，作者们使用了不同的方法提取羽扇豆蛋白，如碱性提取、等电沉淀、超声波提取和超临界CO2提取，并报告了提取方法对蛋白质产量、纯度和功能性的影响（Albe-Slabi等人，2022年；Chukwuejim & Aluko，2024年，2025年；Devkota等人，2023年；Domínguez-Valencia等人，2025年；Tang等人，2025年）。此外，Schlegel等人（2021年）在羽扇豆种子中发现了过敏原蛋白，并表明酶水解结合发酵可以有效减少过敏原。尽管已经探索了多种羽扇豆蛋白提取方法，但研究ChCl-甘油DES系统对蛋白质功能性和质量的影响既及时又必要。鉴于先前研究中报告的提取蛋白质成分的功能性和质量方面的局限性，以及需要可持续、低成本的方法来提高蛋白质产量，这一点尤为重要。

此外，白色羽扇豆的蛋白质组成与其他植物蛋白来源不同（Ma等人，2025年），其与DES的相互作用也不同，导致提取的蛋白质具有独特的肽和氨基酸谱。这些变化可能会改变蛋白质成分的功能性、消化率和整体氨基酸组成，从而影响它们在各种食品应用中的适用性（Hanafi等人，2024年）。因此，需要系统地优化羽扇豆蛋白提取的条件，并彻底评估提取蛋白质成分的功能性和质量，以确定其在未来食品系统中的适用性。此外，使用任何提取方法获得的羽扇豆蛋白分离物的氨基酸谱和消化率仍有很大的探索空间。

假设使用含有ChCl和甘油的DES系统优化蛋白质提取条件可以提高羽扇豆蛋白的蛋白质含量、提取产量和技术功能特性，优于碱性提取。因此，本研究的目的是使用响应面方法（RSM）优化羽扇豆蛋白提取条件，包括三个变量：液固比、提取时间和水分含量，并在优化条件下表征DES提取蛋白质的物理化学、技术功能性和蛋白质质量参数，以及与传统碱性提取的蛋白质进行比较。

材料

加拿大阿尔伯塔省卡尔加里的Lupin Platform Inc.提供了粒径为0.2毫米的白色羽扇豆粉。氯化胆碱（>99.0%）、甘油（>99.5%）、Coomassie brilliant blue G250、Bradford蛋白质测定试剂盒、Folin–Ciocalteu试剂、没食子酸和Megazyme酶试剂盒K-PHYT从Fisher Scientific（加拿大安大略省渥太华）购买。Precision plus蛋白质标准品（10–250 kDa）、Laemmli样品缓冲液、Coomassie blue R250、2-mercaptoethanol和预制凝胶（4–15%）也从其他地方购买。

蛋白质提取优化及蛋白质产量和回收率的评估

应用响应面方法（RSM）（表2）得出了以下回归方程，说明了蛋白质产量与测试自变量之间的经验关系：

使用RSM优化羽扇豆蛋白提取共进行了15次实验，包括3个中心点，涉及3个变量：X₁ - 固液比（w/w）、X₂ - 水分含量 %（w/w）、X₃ – 提取时间（分钟）。响应变量为蛋白质产量（mg/g DW）。

结论

通过ChCl-甘油基DES提取获得的较高蛋白质产量和回收率表明其在工业应用中的扩展潜力。相比之下，碱性提取导致羽扇豆蛋白分离物的颜色变化较大且蛋白质变性更严重，这可能对其在某些食品应用中的适用性产生负面影响。值得注意的是，DES提取通过增强α-螺旋和β-折叠成分保持了结构完整性。

CRediT作者贡献声明

哈沙尼·纳迪沙尼（Harshani Nadeeshani）：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 原稿、可视化、验证、方法学、数据分析。阿努鲁迪卡·赫瓦奇（Anuruddika Hewage）：撰写 – 审稿与编辑、可视化、方法学。阿曼达·G.A. 萨（Amanda G. A. Sá）：撰写 – 审稿与编辑、验证、方法学。赵宇（Yu Zhao）：撰写 – 审稿与编辑。南迪卡·班达拉（Nandika Bandara）：撰写 – 审稿与编辑、监督、软件管理、资源协调、项目管理、资金获取、数据分析。

未引用的参考文献

AOAC International和Latimer，2012年；Megazyme Ltd，2019年；Sá等人，2023a；Sá等人，2023b；Vogelsang-O’Dwyer等人，2020年；Vogelsang-O’Dwyer等人，2020年。

利益声明

作者声明没有需要声明的利益冲突。

竞争利益声明

? 作者声明没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

资金致谢

该项目得到了曼尼托巴大学研究生奖学金（UMGF）、加拿大Nandika Bandara博士的研究主席计划（950-232983）、自然科学和工程研究委员会（RGPIN 2020-07136）（加拿大，项目负责人：Nandika Bandara）、加拿大创新基金会（CFI）以及曼尼托巴省政府和加拿大政府的可持续加拿大农业伙伴关系（SCAP）的支持，包括研究和创新流项目资助（AGR00024-T00040，AGR00025-T01062）。