《Food Hydrocolloids》：Complex Formation of Lactoferrin and Whey Protein Hydrolysate: Multiscale Structural Analysis, Thermal Stability, and Functionality
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乳铁蛋白与乳清蛋白水解物通过调节浓度比、pH、温度和时间形成复合物，热稳定性显著提升且保留抗菌活性。
作者列表：林天天 | 周宇峰 | 王旭西 | 达德莫哈马迪尤纳斯 | 梅莱塔拉伊尔哈里 | 卡普尔罗希特 | 阿巴斯普拉德阿里雷扎
美国纽约州伊萨卡市康奈尔大学农业与生命科学学院食品科学系
摘要
通过调整反应浓度、混合比例、pH值、孵育温度和时间，实现了乳铁蛋白（LF）与乳清蛋白水解物（WPH）之间的复合物形成。通过浊度、ζ电位和粒径分析确认，在LF与WPH的质量比为1:1和1:2时，在pH值5.8-6.0范围内，当混合浓度为1 w/v%并在25°C下孵育30分钟，或混合浓度为3 w/v%并在45°C下孵育30分钟时，复合物形成效果最佳。离心和冻干后，复合物的产率为36-40%，其中LF占复合物质量的43-48%。扫描电子显微镜显示，1:1比例的LF-WPH复合物为棒状或立方体状颗粒，粒径在100-300纳米之间；而1:3比例的可溶性复合物为小于100纳米的立方体状颗粒。根据小角X射线散射分析，在分子水平上，LF-WPH复合物的最大伸展距离为40-60纳米，呈椭圆形。在pH 5.8条件下，当LF与WPH的质量比为1:1和1:2时，LF-WPH复合物在75°C下加热2分钟或在90°C下加热2-60秒后表现出增强的热稳定性，这一结果通过HPLC、SDS-PAGE和CD光谱得到验证，显示在75°C下加热2分钟后LF的保留率超过80%，在90°C下加热2分钟后保留率为70%。与纯LF相比，LF-WPH复合物在加热后仍保持对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抗菌活性。
引言
人们对乳铁蛋白（LF）的兴趣重新高涨，这种基于牛奶的生物功能性蛋白能够通过直接结合病毒颗粒或阻碍其宿主细胞受体来抑制SARS-CoV-2病毒感染（Campione等人，2021；Mirabelli等人，2021；Wotring等人，2022）。许多研究还表明，LF是一种重要的生物活性蛋白，因为它具有结合铁、抗菌、抗病毒、抗炎和抗癌的特性（King等人，2007；L?nnerdal & Iyer，1995；Vogel，2012）。然而，LF的生物功能与其天然蛋白质结构和构象密切相关。商业热处理过程会导致LF变性，改变其天然结构并影响其生物功能（Goulding等人，2021；Martysiak-?urowska等人，2022；Sreedhara等人，2010）。
LF的热稳定性与其结构和铁饱和度以及环境条件（如pH值、离子强度和食品基质中其他生物聚合物的存在）密切相关。LF的糖基化模式影响其分子量和离子强度，进而影响其热稳定性。LF三聚体（约250 kDa）比天然LF具有更高的热稳定性和抗蛋白水解能力，这可能与其更完整的结构有关（Ebrahim等人，2014）。LF的铁饱和度越高，其蛋白质结构越紧凑，因此热稳定性也越高（B. Wang等人，2019）。缺铁的Apo-LF的热变性温度为70°C，而铁饱和的holo-LF的热变性温度为90°C。天然LF的热稳定性介于这两个温度之间（Bokkhim等人，2013）。LF的热稳定性还受到食品基质环境条件的影响。据报道，Apo-牛乳铁蛋白在pH 4时表现出最高的热稳定性，在pH 7以上经过热处理后倾向于聚集形成浑浊溶液或凝胶（Abe等人，1991）。我们之前的研究表明，LF在pH 5的水溶液中加热后二级结构变化有限，而在pH 7的水溶液中变化显著（T. Lin等人，2022）。另一项研究表明，LF在牛奶中的热稳定性低于磷酸盐缓冲液中，这可能是由于牛奶加热过程中酪蛋白与LF之间的相互作用（Sánchez等人，1992）。
牛乳铁蛋白是从牛奶和乳清中直接获得的成分。由于天然LF的热变性温度接近大多数食品的巴氏杀菌条件，因此在热处理过程中LF的功能性和生物活性会丧失，限制了其在商业产品中的应用。提高LF的热稳定性将扩大其在食品和营养产品中的用途。
目前，微胶囊化是最常用的保护LF免受热降解的方法，例如复凝聚、双层胶囊制备和水包油包水乳液（Balc?o等人，2013；Kilic等人，2017；T. Lin等人，2021）。先前的研究已经证明了利用LF与阴离子多糖或蛋白质之间的复合作用来提高乳铁蛋白热稳定性的有效性（Bastos等人，2018；T. Lin等人，2023；Zhou等人，2024）。LF带正电荷，在较宽的pH范围内（< 8）可溶于水溶液，因为其等电点在8到9之间（Bokkhim等人，2013）。这些特性促进了LF与许多阴离子生物化合物（如阿拉伯胶、果胶、大豆蛋白和豌豆蛋白）之间的静电吸引和复合物形成，研究人员对此进行了深入研究（Adal等人，2017；Bengoechea等人，2011；da S. Gul?o等人，2014；Q. Li & Zhao，2017；Zheng等人，2020）。通过复合作用或共凝聚增加蛋白质稳定性是由于降低了蛋白质的移动性并抑制了蛋白质的展开，从而防止了蛋白质结构的损害（T. Lin等人，2023；Santos等人，2018）。
最近，我们使用多糖、LF和明胶制备了一种新型的三组分复合物结构——共凝聚体中的共凝聚体，这种结构在中性pH条件下提高了LF的热稳定性（T. Lin等人，2023）。然而，这些研究在食品工业中的应用仍面临一些挑战。例如，多糖可能不适用于乳制品或婴儿配方奶粉，因为它们可能会降低总蛋白质含量。其他植物基或乳制品基蛋白质可能具有较低的热稳定性或溶解度，因此在某些加工条件下对LF的保护作用有限（Finnegan等人，2024；Gao等人，2024；L. Grossmann & McClements，2023；Wijayanti等人，2014）。
为了克服这些挑战，我们使用乳清蛋白水解物（WPH）制备了LF复合物。WPH被认为是一种新兴的可持续食品成分，因为它是在奶酪制作过程中产生的副产品。WPH在pH 7时带负电荷，其等电点约为4.5，因此在酸性pH（约2-3）和中性pH下具有水溶性和热稳定性。这些特性使其成为通过与带正电荷的LF通过静电相互作用形成复合物的良好候选者。此外，与完整蛋白质相比，WPH可能暴露出更多的带电氨基酸残基，从而增加与LF的复合作用。基于WPH的产品也被证明比牛奶蛋白引起的过敏反应更少（Cui等人，2023）。最后，据报道WPH还具有一定的生物功能和活性，如抑制血管紧张素转化酶（ACE）的能力、抗氧化活性和促进组织修复（Athira等人，2015；Buckley等人，2010；Martin等人，2020；S. Wang等人，2022）。尽管之前已有报道多糖与蛋白质水解物之间的复合作用（L. Lin等人，2022；Trujillo-Ramírez等人，2018；J.-N. Yan等人，2021），但蛋白质与蛋白质水解物之间的复合作用研究较少。有一项研究报道了使用合成多肽进行蛋白质包封（Black等人，2014）。然而，LF与WPH之间的复合物形成及其对蛋白质热稳定性的影响尚未得到探索。
基于WPH在pH 7时的整体负电荷及其热特性，我们假设LF将通过静电相互作用与WPH形成复合物，这种复合物在加热后将提高LF的热稳定性并保持其功能性。因此，本工作的目标是制备乳铁蛋白-乳清蛋白水解物（LF-WPH）复合物，表征复合物结构，并评估配方复合物中的LF热稳定性和功能性。优化了混合比例、pH值、孵育温度和时间的复合物形成条件。通过光学显微镜、扫描电子显微镜和小角X射线散射（SAXS）分析了复合物结构。评估了LF的热稳定性和抗菌活性，以评估这种LF复合物在食品产品中的潜在应用。
材料
乳铁蛋白（天然牛乳铁蛋白，Bioferrin 2000，蛋白质含量（按提供的比例）>93%，总蛋白质中的乳铁蛋白含量 >15mg/100g）由Glanbia Nationals, Inc.（美国伊利诺伊州芝加哥）提供。乳清蛋白水解物（WPH）（蛋白质含量按提供的比例为91.4%，水解度为10-11%）是从当地市场购买的商业产品。WPH的分子量分布及其在不同pH值下的ζ电位分别显示在图S1和S2中。
pH值和质量比对LF-WPH复合物形成的影响
为了了解和确定LF与WPH之间的最佳复合物形成条件，研究了不同浓度、pH值和混合比例下的单个生物聚合物溶液及混合溶液（未经进一步离心、冻干和重悬）的ζ电位、粒径和浊度（第3.1节和3.2节）。初步研究表明，在不同pH值下，1 w/v% LF和1 w/v% WPH溶液的ζ电位相反
结论
本研究系统地研究了乳铁蛋白（LF）与乳清蛋白水解物（WPH）之间的复合物形成，WPH是一种作为奶酪制作副产品获得的可持续成分。我们证明了LF和WPH可以通过简单且可扩展的过程形成静电驱动的复合物。此外，复合物的形成可以通过混合比例、pH值、孵育温度和总生物聚合物浓度进行调整。确认了最佳的复合物形成条件
作者贡献声明
罗希特·卡普尔（Rohit Kapoor）：撰写 – 审稿与编辑，资源提供。阿里雷扎·阿巴斯普拉德（Alireza Abbaspourrad）：撰写 – 审稿与编辑，监督，资源提供，资金获取。周宇峰（Yufeng Zhou）：撰写 – 审稿与编辑，研究，数据分析。王旭西（Wuxi Wang）：撰写 – 审稿与编辑，研究，数据分析。林天天（Tiantian Lin）：撰写 – 审稿与编辑，初稿撰写，方法学设计，研究，数据分析，数据管理，概念化。尤纳斯·达德莫哈马迪（Younas Dadmohammadi）：撰写 – 审稿与编辑，
致谢
作者感谢Dairy Management Inc.（伊利诺伊州罗斯蒙特）的资助支持。本研究使用了康奈尔材料研究中心（CCMR）的SEM设施，该设施得到了国家科学基金会的资助（奖项编号DMR-1719875）。本研究还使用了康奈尔高能同步辐射源（CHESS）的SAXS设施，该设施得到了国家科学基金会的资助（奖项编号DMR-1829070和DMR-2342336，美国国立卫生研究院的支持
