《Food Microbiology》：Psychrotolerant spoilage bacteria enhanced
Campylobacter jejuni culturability on refrigerated chicken meat
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空肠弯曲杆菌（C. jejuni）在禽类中传播，易进入不可培养但存活（VBNC）状态，传统检测方法易低估其实际数量。本研究分析零售鸡肉在 aerobic、真空及 modified atmosphere 包装下，其微生物群（如 Pseudomonas、Lactococcus 等）对 C. jejuni 在 4℃冷藏 10 天的存活性和可培养性的影响。结果显示：Campy Cefex 平板比 mCCDA 更有效检测 C. jejuni（多 0.74 log10），但两者均低估 2.87 log10 真存活量；真空包装下的 Lactococcus 和 Leuconostoc 显著提升可培养性（>1 log），但此效应在 aerobic 条件下更明显。微生物群通过代谢产物和生物膜作用影响 VBNC 状态，需结合分子技术（如 vqPCR）完善检测体系。
作者：阮然然（Runan Yan）、塞缪尔·C·沃森（Samuel C. Watson）、魏晓媛（Xiaoyuan Wei）、贾斯娜·科瓦茨（Jasna Kovac）
宾夕法尼亚州立大学食品科学系，大学公园，16802 PA
摘要
空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni）是细菌性食源性疾病的主要原因，而家禽是其主要的传播媒介。这种细菌可以进入一种存活但无法培养（VBNC，Viable But Non-Culturable）的状态，这使得基于培养的方法难以检测到它。虽然已知寒冷和氧化应激是导致细菌进入VBNC状态的因素，但家禽相关微生物群在冷藏过程中对空肠弯曲菌的培养能力和存活率的影响仍不明确。本研究探讨了零售鸡肉中的微生物群在10天冷藏期间对空肠弯曲菌的影响，实验条件包括有氧环境和真空环境。我们分析了有氧包装、改良气氛包装以及真空包装的鸡胸肉中的微生物群组成。在不同包装条件下，微生物群组成有所不同：有氧条件下以假单胞菌（Pseudomonas）、布罗氏杆菌（Brochothrix）和鲍曼不动杆菌（Acinetobacter）为主；而在真空条件下则以乳球菌（Lactococcus）和乳酸链球菌（Leuconostoc）为主。这些菌株被分离出来，并在4°C下评估了它们的生长能力和生物膜形成能力。耐寒菌株的全基因组序列被用于分析它们对鸡胸肉中空肠弯曲菌存活率和培养能力的影响。三种微生物组处理方案（T1：假单胞菌、布罗氏杆菌、鲍曼不动杆菌；T2：乳球菌、乳酸链球菌；T3：T1和T2的组合）与空肠弯曲菌共同接种后，在4°C下储存。存活率通过活力qPCR检测，培养能力通过Campy Cefex和mCCDA琼脂平板计数进行评估。结果显示，Campy Cefex培养基在第10天时回收的空肠弯曲菌数量显著高于mCCDA培养基（分别多出0.74 log10），但后者低估了实际存活细胞浓度（低2.87 log10）。所有微生物组处理方案在有氧条件下均提高了空肠弯曲菌的培养能力（超过1 log），但在真空条件下效果不明显，这表明需要进一步研究非病原体与有氧储存肉类中空肠弯曲菌之间的相互作用。总体而言，基于培养的方法低估了空肠弯曲菌的存活率，强调了在食品安全评估中结合分子定量分析的必要性。
引言
空肠弯曲菌属（Campylobacter）是细菌性食源性疾病的主要原因，每年在美国导致约150万例病例（CDC，2023年）。其中，空肠弯曲菌引起的感染占大多数，而其他菌种（如大肠杆菌（C. coli）、乌普萨拉弯曲菌（C. upsaliensis）、胎儿弯曲菌（C. fetus）和拉里弯曲菌（C. lari）引起的感染则较为罕见（Francois Watkins等，2021年；Igwaran和Okoh，2019年；Patrick等，2013年；Sheppard和Maiden，2015年）。食用受污染的食物、饮用水以及与受感染或携带细菌的动物密切接触（Hyllestad等，2020年；Mughini-Gras等，2021年）都被认为是空肠弯曲菌感染的来源。在这些传播途径中，家禽肉被认为是人类空肠弯曲菌病的主要来源（Cody等，2019年；Harrison等，2021年；Thépault等，2017年）。该细菌能够在禽类的生殖器官、肠道和口腔中无症状存在，从而在禽群中迅速传播。此外，家禽的体温高于其他食用动物，使其肠道成为空肠弯曲菌的理想生存环境（Robyn等，2015年；Scupham，2009年；Troxell等，2015年）。因此，家禽仍然是空肠弯曲菌传播的主要来源，食用生的或未煮熟的家禽肉是感染空肠弯曲菌的重要风险因素。
空肠弯曲菌属的生长需要特定的条件，包括微需氧环境、30至42°C的最佳温度以及氨基酸的供应。该细菌在含3%至15%氧气的环境中生长，这使其被归类为专性微需氧菌（Brenner, D.J.；Krieg, N.R.，2005年；Kaakoush等，2007年；Velayudhan等，2004年）。其生长受限的原因包括对活性氧的耐受性较低、无法产生足够的抗氧化酶、呼吸速率低以及存在对氧气敏感的关键酶（Krieg和Hoffman，1986年；Velayudhan等，2004年）。此外，空肠弯曲菌不合成冷休克蛋白，这限制了其在接近最低生长温度下的生长能力。
在高氧水平、低温、营养缺乏或接触抗菌剂等压力条件下，空肠弯曲菌可以进入存活但无法培养的状态（Zhang和Lu，2023年）。进入这种状态后，细菌具有生存优势，因为它们能在面对压力时在环境中持续存在（Reichelt等，2023年；Santos等，2023年）。在VBNC状态下，细胞代谢活动降低，使得标准培养方法无法检测到它们，这对传统的食品安全检测方法构成了挑战（Lv等，2020年；Stingl等，2021年；Zhang和Lu，2023年）。令人担忧的是，VBNC状态的细菌在恢复后仍然具有活力且可能具有传染性（Cappelier等，1999年；Chaisowwong等，2012年；Chaveerach等，2004年）。生物因素（尤其是食品中的微生物群）对空肠弯曲菌培养能力和存活率的影响尚不明确，需要进一步研究。为填补这些知识空白，研究人员开发了先进的分子技术，如活力定量PCR（vqPCR）（Stingl等，2021年；Zhang和Lu，2023年）。这些技术能够区分具有完整细胞膜的活细胞和膜受损的死细胞的DNA，从而有助于检测VBNC状态的空肠弯曲菌。将vqPCR与传统的培养方法结合使用，有助于我们更好地理解影响空肠弯曲菌培养能力的因素，这对于提高该病原体的检测能力和食品安全风险评估的准确性至关重要。
本研究重点关注鸡肉中的生物相互作用，特别是微生物群对空肠弯曲菌存活率和培养能力的影响，以提供了解该病原体在家禽肉中持续存在机制的新视角。首先，我们分析了不同包装条件下鸡胸肉和整鸡中微生物群的组成差异，确定了样本中的核心微生物属。随后，我们分离出这些核心属的菌株，并评估了它们在冷藏条件下的生长能力和生物膜形成能力。接着，使用耐寒性的核心属菌株来评估它们对冷藏过程中鸡肉中空肠弯曲菌培养能力和存活率的影响。
部分内容摘录
零售鸡肉样本的收集和鸡肉微生物群的检测
零售鸡肉样本于2020年8月至2020年12月期间从杂货店购买。购买的肉样包括三种包装条件下的鸡胸肉（有氧、改良气氛和真空包装）以及有氧包装下的整鸡。每种肉类和包装类别各收集了10个样本，共计40个样本。为了最大化微生物群的多样性，我们收集了来自不同加工方式的样本。
零售鸡肉微生物群的组成因包装条件及鸡胸肉与整鸡的不同而有所差异
使用16S rRNA扩增子测序技术分析了40个零售鸡肉样本（n = 40）的微生物群组成，这些样本包括有氧包装的整鸡（n = 10个）和真空包装的鸡胸肉（n = 10个）、有氧包装的鸡胸肉（n = 10个）以及改良气氛包装的鸡胸肉（n = 10个）。在所有样本中，共鉴定出453个科级别的分类单元和999个属级别的分类单元（图1）。其中，57个属属于45个科。
结论
有氧包装的鸡胸肉、真空包装的鸡胸肉以及有氧包装的整鸡中的微生物群组成存在差异。在10天的冷藏后，使用Campy Cefex琼脂培养基从接种了空肠弯曲菌的鸡胸肉中回收的细菌数量明显多于使用mCCDA琼脂培养基（P<0.05）。这表明Campy Cefex培养基可能更准确地量化鸡肉中的活空肠弯曲菌数量。值得注意的是，两种琼脂培养基的结果相似。
作者贡献声明
贾斯娜·科瓦茨（Jasna Kovac）：撰写、审稿与编辑、监督、资源协调、项目管理、方法设计、资金获取、数据分析、概念构思。
魏晓媛（Xiaoyuan Wei）：撰写、审稿与编辑、实验设计、数据分析。
塞缪尔·C·沃森（Samuel C. Watson）：撰写、审稿与编辑、数据可视化、实验设计、数据分析。
阮然然（Runan Yan）：撰写、审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化、方法设计、实验设计、资金获取。
未引用的参考文献
Brenner和Krieg，2005年；Chaisowwong等，2012a年。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
数据获取
Illumina和Nanopore测序数据可在NCBI上通过BioProject访问号PRJNA714412获取。
资金来源
本研究得到了美国农业部（USDA National Institute of Food and Agriculture）和Hatch项目的资助（项目编号PEN04853，访问号7005519），以及多州项目4666、宾夕法尼亚州立大学农业科学学院（Penn State College of Agricultural Sciences）的竞争性研究生研究基金和mBiome SNIP研究生奖学金，还有Lester Earl和Veronica Casida职业发展基金的支持。
利益冲突声明
? 作者声明以下财务利益或个人关系可能被视为潜在的利益冲突：贾斯娜·科瓦茨（Jasna Kovac）表示获得了美国农业部的资金支持。如果还有其他作者，他们也声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
