《Food Research International》：Engineering lactococci to reduce human lactose intolerance; biotechnology and risk/benefit assessment toward the gut microbiota of lactose-intolerants
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本研究针对乳糖不耐受人群的肠道健康问题，通过基因工程技术构建了分泌型β-半乳糖苷酶的乳酸乳球菌工程菌株559，实现了牛奶中41.3%的乳糖水解。采用INFOGEST?消化模型和MICODE结肠发酵模型进行体外风险评估，发现经工程菌处理的低乳糖牛奶可显著促进双歧杆菌等有益菌增殖，增加短链脂肪酸等有益代谢物，为开发新型低乳糖乳制品提供了理论依据和技术支撑。
乳糖不耐受是全球性的健康问题，患者因体内缺乏β-半乳糖苷酶（ lactase）而无法有效分解乳制品中的乳糖，导致腹胀、腹泻等不适症状。传统乳糖水解技术依赖从酵母或霉菌中提取的β-半乳糖苷酶，但酶提取过程成本高昂且工艺复杂。随着生物技术的发展，利用全细胞催化策略避免酶纯化步骤成为研究热点。乳酸乳球菌（Lactococcus cremoris）作为食品安全级（GRAS）的乳酸菌，在乳制品发酵中具有广泛应用基础，是理想的工程菌株宿主。
为解决上述问题，研究团队通过基因工程技术构建了两种表达双歧杆菌来源β-半乳糖苷酶基因bdg2A的乳酸乳球菌工程菌：菌株558（细胞壁锚定型）和菌株559（分泌型）。通过比较两种菌株的酶活性、质粒稳定性和乳糖水解效率，筛选出性能更优的菌株559用于低乳糖牛奶制备。随后采用体外消化-发酵耦合模型（INFOGEST?+MICODE）评估经工程菌处理的低乳糖牛奶对乳糖不耐受者肠道菌群的调控作用，通过微生物组学和代谢组学分析揭示其潜在的健康效益。
关键技术方法包括：基因工程改造乳酸乳球菌表达双歧杆菌来源的β-半乳糖苷酶；利用高效液相色谱（HPLC）测定乳糖水解率；采用体外模拟消化（INFOGEST?）和结肠发酵（MICODE）模型；通过实时荧光定量PCR（qPCR）分析肠道菌群组成变化；运用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用（SPME-GC-MS）技术检测挥发性有机化合物（VOCs）。
3.1. 乳酸乳球菌菌株的生化测试
3.1.1. β-半乳糖苷酶Bdg2A在乳酸乳球菌中的细胞壁附着和胞外表达
通过酶活测定发现，菌株559在培养上清液中表现出最高β-半乳糖苷酶活性，证实其成功实现酶分泌。有趣的是，菌株559的完整细胞也显示出与菌株558相似的酶活性，推测部分分泌酶通过非共价结合吸附于细胞表面。
3.1.2. 产β-半乳糖苷酶Bdg2A的重组乳酸乳球菌菌株能够发酵乳糖
生长曲线实验表明，工程菌株558和559均能利用乳糖作为唯一碳源生长，而对照菌株362无此能力。菌株559在乳糖培养基中的生长效率最高，最终菌体密度与葡萄糖培养基相当。
3.1.3. 质粒稳定性
质粒稳定性测试显示，在乳糖培养基中培养40代后，菌株559仍保持20%的质粒保留率，显著高于菌株558（完全丢失质粒）。表明乳糖作为选择性压力有利于质粒维持。
3.1.4. 牛奶中乳糖的水解
在脱脂牛奶中培养48小时后，菌株559消耗了41.3%的乳糖，而菌株558仅消耗6.4%。菌株559的活菌数达到9.40±0.05 Log CFU/mL，pH降至6.00±0.12，证明其具有良好的发酵特性。
3.2. 处理牛奶的体外结肠发酵
3.2.1. 核心微生物群相关类群的变化
qPCR结果显示，经菌株559处理的低乳糖牛奶（EM）使肠道总细菌（Eubacteria）数量增加0.72倍，而普通牛奶（CM）导致细菌数量减少。特别值得注意的是，EM使双歧杆菌科（Bifidobacteriaceae）数量显著增加1.87倍，而CM导致其减少1.76倍。此外，EM还促进了Faecalibacterium prausnitzii等有益菌的生长。
3.2.2. 通过SPME GC/MS进行挥发组学分析
PCA分析发现，EM发酵产生的有益挥发物主要为乙酸、丙酸、己酸和戊酸等短链脂肪酸（SCFAs），而CM则主要产生草酸等潜在有害化合物。在醛类化合物中，EM特征性地产生己醛、庚醛等氧化性醛类，而CM主要产生苯乙醛等有害醛类。
3.2.3. 主要微生物VOCs的变化
定量分析显示，EM发酵使乙酸、丙酸和丁酸分别比CM多产生2.58、12.19和8.65倍。相反，CM发酵导致戊酸和己酸等中链脂肪酸减少，而EM使其增加。在有害代谢物方面，EM有效抑制了粪臭素（Skatole）和吲哚（Indole）的产生，分别比CM多减少2.79和2.44倍。
本研究成功构建了分泌型β-半乳糖苷酶的乳酸乳球菌工程菌株559，证实其能有效水解牛奶中41.3%的乳糖。通过先进的体外肠道模型评估发现，经工程菌处理的低乳糖牛奶能显著调节乳糖不耐受者肠道菌群结构，促进双歧杆菌等有益菌增殖，增加短链脂肪酸等有益代谢物，同时抑制有害化合物的产生。尽管当前乳糖水解率尚未达到完全去除水平，但该研究为开发新型低乳糖乳制品提供了创新性技术路线和理论依据，标志着食品生物技术向精准营养方向迈出了重要一步。未来研究需进一步优化菌株性能，提高乳糖水解效率，并开展临床验证以推动产业化应用。
