越南人参UDP-鼠李糖基转移酶PviUGT74鉴定及其在伪人参皂苷F11生物合成中的功能解析

《Industrial Crops and Products》：A UDP-rhamnosyltransferase (PviUGT74) in Panax vietnamensis var. fuscidiscus completing pseudoginsenoside F 11 biosynthesis

本研究针对越南人参变种中伪人参皂苷F11生物合成最后一步糖基化机制不明的科学问题，通过全基因组筛选和体外酶活验证，首次鉴定出特异性催化PRT5C6-O-鼠李糖基化的关键酶PviUGT74。该酶在近中性pH和温和温度条件下表现最优活性，且对UDP-鼠李糖具有严格特异性。分子对接与定点突变实验揭示H21-D120催化二元体等7个关键残基的功能作用，同源基因功能保守性及基因复制起源分析为UGT家族进化提供新见解。该发现完善了ocotillol型皂苷生物合成途径，为通过合成生物学策略可持续生产稀有皂苷奠定了理论基础。

　　

在传统中医药宝库中，人参属植物因其富含具有药理活性的皂苷成分而备受推崇。其中，ocotillol型（OCT型）皂苷因其独特的20,24-环氧桥结构而区别于常见的达玛烷型皂苷，展现出显著的神经保护、抗缺血和抗炎活性。伪人参皂苷F₁₁（PF₁₁）作为OCT型皂苷的代表，虽已发现其能通过减少β-淀粉样蛋白积累和调节细胞凋亡通路发挥治疗潜力，但其生物合成途径，特别是最后一步糖基化反应的关键酶一直未被揭示。这一科学瓶颈严重制约了通过代谢工程手段实现PF₁₁的可持续生产。

为了破解这一难题，研究人员将目光投向了OCT型皂苷含量丰富的越南人参变种（Panax vietnamensis var. fuscidiscus）。此前研究已初步勾勒出OCT型皂苷的生物合成轮廓：PviOSC6催化形成核心三萜骨架(20S,24R)-20,24-环氧达玛烷二醇，PvfUGT1和PgUGT94Q13等酶逐步催化后续糖基化步骤生成中间产物如PRT₅。然而，将PRT₅转化为PF₁₁所需的C6-O-鼠李糖基化步骤仍是缺失的最后一块拼图。鉴定负责此步催化的UDP-鼠李糖基转移酶（URT）对于完整解析该通路至关重要。

本研究发表于《Industrial Crops and Products》，综合运用了基因组学、分子生物学、生物化学和生物信息学等多种技术手段。研究人员首先从云南金平县的三年生越南人参变种植株中采集叶片样本用于RNA提取和基因克隆。通过全基因组分析鉴定了该物种中的UGT基因家族，并利用系统发育分析筛选候选基因。功能验证方面，将候选UGT基因在原核表达系统（大肠杆菌BL21）中进行重组蛋白表达与纯化，通过体外酶活反应结合高效液相色谱-蒸发光散射检测器（HPLC-ELSD）和液质联用（LC-MS）技术分析酶催化活性及产物。采用分子对接和定点突变技术深入探究了酶的催化机制和关键氨基酸残基。此外，还通过同源基因功能比较、系统发育基因组学和共线性分析探讨了该基因的进化起源。

3.1. PVF中UGT基因的全基因组分析

研究人员从越南人参变种基因组中鉴定出110个非冗余的UGT基因。理化性质分析表明这些蛋白具有典型可溶性胞质酶的特征。基因结构和保守基序分析显示密切相关的PviUGT成员具有相似的结构组织。染色体定位显示基因分布不均匀，多集中于染色体末端。基因复制事件分析表明UGT家族的扩张主要源于全基因组复制、转座复制和串联复制。共线性分析和Ka/Ks计算进一步表明该基因家族在进化中受到强烈的纯化选择。

3.2. UGT基因的系统发育分类和组织特异性表达

系统发育分析将110个PviUGT基因划分为21个亚家族，其中UGT85亚家族成员最多。有15个候选基因与已知参与人参皂苷生物合成的UGT94、UGT73、UGT71和UGT74亚家族成员聚在一起，提示它们可能具有类似功能。组织特异性表达谱分析显示，不同PviUGT基因在根、根茎、茎、叶、花中呈现差异表达模式，其中PviUGT31和PviUGT74在主要根和根茎中表达最高，暗示它们在根部次生代谢中的重要作用。

3.3. PviUGT74的功能表征和生化特性

通过对15个重组UGT蛋白进行体外酶活筛选，发现唯有PviUGT74能够以PRT₅为底物，UDP-鼠李糖（UDP-Rha）为糖供体，催化生成与PF₁₁标准品保留时间和质谱信号一致的反应产物，从而证实了其催化PRT₅生成PF₁₁的功能。该酶还展现出对其他人参皂苷底物（如Rh1和Rg1）的催化活性，说明其具有较宽的底物谱。酶学性质研究表明，PviUGT74在最适温度30℃、最适pH 6.8的PBS缓冲液中活性最高，反应3小时即可高效完成转化。Zn²⁺和Cu²⁺等金属离子会抑制其活性。酶动力学分析符合米氏方程，计算得出其催化效率参数。

3.4. PviUGT74的糖供体特异性和催化机制

糖供体特异性实验表明PviUGT74严格依赖UDP-Rha，对其他UDP-糖（如UDP-葡萄糖、UDP-半乳糖等）无催化活性。分子对接模型显示，酶的N端结构域结合底物PRT₅，C端结构域结合UDP-Rha。关键残基H21可能负责PRT₅羟基的去质子化，并与D120形成催化二元体。定点突变实验证实，H21A和D120A突变体完全丧失活性，而E273、W355、G356、Y375和E376等残基的突变也显著降低催化效率，这些残基主要通过氢键相互作用稳定UDP-Rha和过渡态。

3.5. 同源基因鉴定及PviUGT74在五加科的进化起源和新功能化

序列比对发现PviUGT74与其他六种人参属物种的同源基因具有高度相似性。功能实验证实这些同源酶均能催化PRT₅生成PF₁₁，表明鼠李糖基化功能在人参属中具有进化保守性。共线性分析显示，PviUGT74基因在除刺五加（Eleutherococcus senticosus）外的所分析的五加科物种基因组中存在保守的微共线性区域，推测该基因是在刺五加谱系与人参属谱系分化后出现的。进一步分析其复制起源表明，PviUGT74源于PviUGT94的转座复制，但功能实验显示PviUGT94不能催化PF₁₁的生成，提示PviUGT74是通过新功能化获得了这一新颖的催化功能。

研究结论与讨论部分强调，本研究成功鉴定并表征了PviUGT74作为完成PF₁₁生物合成最后一步的关键酶。这不仅填补了OCT型皂苷生物合成路径的空白，也为了解植物UGT家族的催化机制和进化提供了重要案例。研究所揭示的催化残基及其作用机制，特别是H21-D120催化二元体，对于理解UGT酶底物识别和催化特异性具有普遍意义。基因复制后新功能化的进化模式解释了人参属植物次生代谢物多样性的形成机制之一。该研究成果为未来利用合成生物学技术和代谢工程策略，在微生物或植物底盘细胞中高效、可持续地生产具有重要药用价值的稀有皂苷（如PF₁₁）提供了关键的基因元件和理论依据，有望减少对野生植物资源的依赖，满足医药市场需求。