基于蛋白质生成模型与能量优化设计开发高效ISDra2 TnpB转座酶突变体

《aBIOTECH》：Engineering high-efficiency mutants of the transposase ISDra2 TnpB via protein-generative models and energy-optimized design

本研究针对TnpB核酸酶在哺乳动物细胞中编辑效率低的问题，开发了整合生成式蛋白质模型与能量最小化虚拟筛选的TnpB-GMRE平台。通过从10万个生成序列中筛选获得TnpB-TD突变体，其编辑活性提升50%至17.7%，且具备更强的长片段删除能力。该工作为紧凑型核酸酶的优化提供了新范式。

　　

基因编辑技术特别是CRISPR/Cas系统的发现为生命科学领域带来了革命性变革，然而这些系统通常依赖大分子蛋白，限制了其在动物体内通过单次AAV注射或细菌外膜囊泡进行靶向递送的效率。转座子相关TnpB作为Cas12核酸酶的进化祖先，以其紧凑尺寸（约400个氨基酸）和已在链霉菌和哺乳动物系统中验证的基因编辑活性，近年来引起广泛关注。其中源自耐辐射奇球菌的ISDra2 TnpB-ωRNA系统是首个经过验证的基因编辑平台，但现有工程策略有限，导致其在哺乳动物细胞中的编辑效率仍不理想，制约了更广泛的应用。

为解决这一瓶颈，研究人员开发了名为TnpB-GMRE的创新方法，该方法将TnpB的生成式蛋白质模型与基于最小恢复率和能量最小化的虚拟筛选流程相结合。通过使用大型蛋白质预训练模型MP-TRANS构建TnpB生成模型，研究团队直接计算机生成了10万个ISDra2 TnpB的多点突变体，并通过计算它们的最小恢复率和能量进行功能性和结构稳定性评估。从排名靠前的候选序列中，研究人员选择了五个能量最低的TnpB突变体进行实验验证。

研究结果显示，在不需要流式细胞分选或抗生素选择等富集策略的情况下，五个突变体中的三个在四个靶位点表现出更高的编辑活性。其中TnpB-TD突变体实现了最高编辑活性（17.7%），与原始ISDra2 TnpB相比提高了50%。此外，TnpB-TD突变体在编辑谱系上表现出更大多样性，并且在删除长片段（>10 bp）方面比完整的ISDra2 TnpB更有效。

分子动力学模拟揭示了TnpB-TD突变体与野生型相比具有更多低能构象状态，并表现出表面正电荷增加，这表明其结构稳定性可能是编辑性能增强的基础。该策略为优化紧凑型核酸酶提供了框架，并拓宽了基因编辑应用的可用工具包。

在技术方法方面，研究主要涉及：基于同源序列的蛋白质生成模型构建、虚拟突变体库的高通量筛选（结合最小恢复率和FoldX/EvoEF2能量计算）、哺乳动物细胞系（HEK293T）编辑效率评估、以及分子动力学模拟（包括RMSD、RMSF和自由能景观分析）等关键技术。

2. 结果

2.1. TnpB生成模型的开发与功能性突变体的高通量筛选

研究人员以ISDra2 TnpB为查询序列，通过jackhmmer在UniRef90数据库中搜索同源蛋白，获得八个不同相似度阈值的数据集用于微调MP-TRANS模型。其中TnpB-JH100模型表现最优，被选为最终生成模型。使用该模型生成10万个ISDra2 TnpB多点突变体后，通过最小恢复率筛选出前1000个序列，并利用FoldX和EvoEF2计算能量变化，最终选择五个能量最低的突变体进行实验评估。

2.2. TnpB及其突变体在HEK293T细胞中的编辑活性

实验结果表明，TnpB-TD突变体在AGBL-1、AGBL-2、ROSA26-1和ROSA26-3位点的编辑活性分别比野生型提高约20%、21%、46%和50%。同时，野生型ISDra2 TnpB和TnpB-TD突变体在这些位点均保持低脱靶率。编辑谱分析显示TnpB-TD突变体产生更多样化的编辑结果，且长片段编辑能力更强。

2.3. TnpB-TD突变体编辑活性增强的分子机制

结构预测显示TnpB-TD突变体含有A42F、D149E、Q151A、R238N和K256Q五个点突变，均远离催化中心D191、E278和D361。分子动力学模拟表明突变体RMSD值更低，RMSF分析显示REC、WED和RuvC结构域灵活性显著降低。自由能景观分析表明突变体具有更广泛的能量盆地，构象空间更受限。静电势分析发现Q147和Q148残基在突变体中朝向核酸相互作用通道延伸，且正静电势更强，可能有助于结合稳定性。

3. 讨论

本研究成功建立了TnpB突变体的生成模型和高通量虚拟筛选平台，获得了编辑活性显著提升的TnpB-TD突变体。与传统蛋白质工程方法相比，AI辅助设计结合高通量虚拟筛选显著提高了核心基因编辑酶的优化效率。尽管TnpB-TD的编辑效率（17.7%）低于近期报道的增强型TnpB系统，但这是在未使用富集策略条件下的真实编辑性能。未来通过迭代生成轮次和优化训练数据集，可进一步提升编辑活性。该策略可扩展至其他感兴趣蛋白质的工程化，为紧凑型核酸酶的优化提供了新思路。