《Transboundary and Emerging Diseases》：Emergence of a Novel CRESS-DNA Virus Associated with Swine Reproductive Failure in China
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本研究报道了中国猪群中首次发现的一种与生殖障碍相关的新型环状单链DNA病毒——猪巨环病毒（PMCV）。该病毒基因组达9426 nt，是目前已知最大的CRESS-DNA病毒，其复制酶（Rep）蛋白与已知圆环病毒同源性低于23.6%，系统进化分析表明其属于CRESS-DNA病毒中未分类的新家族。研究通过病毒宏基因组学技术鉴定出PMCV，证实其Rep蛋白具有典型ATP酶活性，并在中国南方三省养殖场中检出率达24%（30/125），提示该病毒可能与猪繁殖障碍疾病存在重要关联。
引言
真核生物环状复制酶编码单链DNA（CRESS-DNA）病毒具有基因组小、流行率高和宿主范围广的特点。国际病毒分类委员会（ICTV）目前承认的CRESS-DNA病毒包括圆环病毒科（Circoviridae）、纳米病毒科（Nanoviridae）等7个科。复制酶（Rep）是CRESS-DNA病毒中唯一具有同源性的基因，其N端含有HUH核酸内切酶结构域，C端含有SF3解旋酶结构域，其中滚动环复制（RCR）基序I-III对病毒复制至关重要。
猪源CRESS-DNA病毒包括非致病性的PCV1、引起断奶后多系统衰竭综合征（PMWS）的PCV2，以及与皮炎肾病综合征（PDNS）和繁殖障碍相关的PCV3、PCV4等。病毒宏基因组学技术通过富集病毒样颗粒（VLPs）进行高通量测序，极大促进了新型病毒的发现。近年来GenBank中真核CRESS-DNA病毒数量十年间翻倍，凸显了该类病毒的遗传多样性。
材料与方法
研究针对广东省某存栏3000头母猪的养殖场爆发的繁殖障碍病例，采集死胎组织样本进行病毒宏基因组测序（数据编号CRA024116）。样本经匀浆、过滤和核酸提取后，通过去除核糖体RNA（rRNA）、cDNA文库构建和Illumina HiSeqX10平台测序，使用CLC Genomics Workbench 11.0进行序列组装。
通过设计4对特异性引物（扩增长度2500-3000 bp）完成PMCV全基因组测序。利用MEGA7软件构建基于Rep蛋白的最大似然系统进化树，并通过原核表达系统验证Rep蛋白功能：将缺失N端145个氨基酸的Rep-ΔN145片段克隆至pGEX-GST载体，经IPTG诱导表达和镍柱纯化后，使用Malachite Green法测定ATP酶活性。
结果
病毒宏基因组学分析
死胎组织病毒群落分析显示，新型单链环状DNA病毒与NCBI中KU043433.1序列相似度达85%。通过特异性PCR验证和基因组拼接，获得全长9426 nt的环状基因组，命名为猪巨环病毒（PMCV），其基因组编码9个开放阅读框（ORF），其中ORF1编码1236 nt的Rep蛋白。由于ORF7区域GC含量极高，未能通过常规方法鉴定出典型的衣壳蛋白（Cap）编码区。
PMCV Rep蛋白的生化特征
结构预测显示PMCV Rep具有与PCV2 Rep相似的三维结构，包括N端内切酶结构域、寡聚化结构域和C端SF3解旋酶结构域。重组表达的C端蛋白显示典型ATP酶活性，酶动力学参数为Vmax=1.958±0.254 nmol/min，Km=453.6±121.4 μmol/L。尺寸排阻色谱提示Rep以六聚体形式存在，分子模型显示其与PCV2 Rep六聚体具有相似空间构象（ipTM=0.71，pTM=0.74）。
系统进化与序列分析
Rep蛋白序列比对显示，PMCV与PCV1-4同源性均低于23.6%（最高为PCV4），与人类CRESS-DNA病毒同源性更低。系统进化树表明PMCV独立于已知CRESS-DNA病毒科，属于未分类的新分支。不同PMCV毒株间Rep蛋白相似度为96.6%-99.5%，提示病毒遗传稳定性较高。
流行病学调查
对125份临床样本的检测显示，PMCV总阳性率为24%（30/125），养殖场阳性率达41.18%（14/34），阳性场覆盖广东、广西和湖南三省。样本类型分析显示粪便阳性率最高（57.14%），死胎组织阳性率为28.57%，而血清样本阳性率仅4.88%，提示病毒可能通过粪-口途径传播并与繁殖障碍直接相关。
讨论
本研究发现的PMCV具有CRESS-DNA病毒中最长的已知基因组，其Rep蛋白虽然序列同源性低，但保留了保守的三维结构和ATP酶功能。未能鉴定出典型Cap蛋白可能源于ORF7区域的高GC含量导致的测序困难，这为后续病毒颗粒观察和动物模型构建带来挑战。
值得注意的是，初步检测发现PMCV与PCV2/PCV3存在引物交叉反应，但常规PCR未能扩增出完整PCV2基因组，提示现有商品化检测试剂可能无法区分PMCV感染。病毒在粪便和死胎组织中的高检出率支持其与繁殖障碍的关联，但需进一步研究其作为原发性病原体或免疫抑制触发剂的角色。
结论
PMCV的发现扩展了猪源CRESS-DNA病毒的遗传多样性边界，其独特的基因组特征和流行病学分布为病毒分类学提供了新视角。该病毒与猪繁殖障碍的临床关联性、传播途径和致病机制亟待通过病毒分离和动物实验进一步阐明。
