水稻氮效基因LHT5优异单倍型通过氨基酸转运协同调控耐盐性与氮肥利用效率的机制研究

《Plant Biotechnology Journal》：An Elite Haplotype of Nitrogen-Use-Efficiency Gene LHT5 Enhances Salt Tolerance in Rice

本文发现水稻Lysine-Histidine型转运蛋白基因OsLHT5的一个优异单倍型LHT5HapA，其通过30-bp缺失突变增强氨基酸转运能力，协同提升氮肥利用效率（NUE）和耐盐性。该单倍型通过上调脯氨酸合成关键基因OsP5CS1/OsP5CS2表达，促进渗透调节物质脯氨酸积累，为盐渍土壤中作物稳产增产提供新育种靶点。

　　

1 引言

盐胁迫通过破坏离子稳态和渗透平衡持续制约全球水稻生产，而盐渍土壤中氮素可利用性降低进一步加剧作物减产。尽管植物已进化出包括活性氧清除和Na⁺外排（如OsHKT1;5）在内的耐盐机制，但营养代谢与逆境适应的协同调控机制尚不明确。氨基酸作为氮素运输的主要形态和逆境信号分子，其转运蛋白LHT家族在拟南芥（AtLHT1）和水稻（OsLHT1）中被证实参与氮吸收及抗病反应，然而该家族是否通过氨基酸代谢介导耐盐性仍未知。

2 结果

2.1 OsLHT5的鉴定与功能解析

通过对175份水稻种质进行低氮（LN，0.2 mM NH₄NO₃）与高氮（HN，2 mM NH₄NO₃）田间表型分析，全基因组关联分析（GWAS）定位到染色体4上主效QTL位点qEPNR4，其连锁不平衡区内ORF2（即OsLHT5）在低氮诱导下表达显著上调。亚细胞定位显示OsLHT5定位于细胞膜，与溶质转运蛋白特性一致。

2.2 OsLHT5通过促进氨基酸积累正向调控氮肥利用效率

在Nipponbare背景中构建OsLHT5敲除株系（LHT5-KO），发现其有效分蘖数比（EPNR）、单株产量（YPP）及植株氮积累量均显著降低。氨基酸组学分析表明，突变体中苏氨酸（HN条件下下降74.6%）和甘氨酸（LN条件下下降31.6%）等中性氨基酸含量大幅减少，提示OsLHT5通过广谱氨基酸转运支撑氮同化。

2.3 OsLHT5优异单倍型LHT5^HapA的功能优势

基于编码区变异将OsLHT5划分为三种单倍型，其中LHT5^HapA携带30-bp缺失（第78–107位）和G→A（第194位）突变。三维结构预测显示该缺失改变蛋白N端构象。在过量表达株系中，LHT5^HapA-OE植株的氨基酸总量、干重及氮积累量均显著高于其他单倍型，且田间试验证实其有效分蘖数和氮肥偏生产力（NUE）提升最显著。

2.4 LHT5^HapA通过脯氨酸累积增强耐盐性

150 mM NaCl处理下，LHT5^HapA-OE植株存活率与脯氨酸含量较野生型提高约50%，且脯氨酸合成限速酶基因OsP5CS1和OsP5CS2表达显著上调。通过合成仅含30-bp缺失（LHT5^30bp-OE）或单碱基突变（LHT5^G-A-OE）的基因序列，验证30-bp缺失是同时提升耐盐性和氮效率的关键变异。

2.5 30-bp缺失的分子机制

该缺失可能解除OsLHT5蛋白N端对转运活性的自抑制，增强其对多种氨基酸的亲和力。协同调控模型表明：LHT5^HapA一方面通过增加氨基酸库容促进氮向籽粒分配，另一方面通过脯氨酸合成通路强化渗透调节，实现“营养-抗逆”协同增效。

3 讨论

本研究首次揭示氨基酸转运蛋白可通过代谢重编程耦合氮效率与耐盐性。LHT5^HapA单倍型在生殖生长期提高籽粒千粒重，在营养生阶段增强渗透调节能力，突破传统抗逆育种常伴随产量损失的瓶颈。基于30-bp缺失的基因编辑策略为培育盐碱地高产水稻提供新路径，但该缺失对转运底物选择性的影响及是否存在茉莉酸（JA）等交叉信号通路仍需深入解析。

4 材料与方法

实验采用3K水稻基因组计划的175个核心种质，通过CRISPR-Cas9构建突变体，利用氨基酸全自动分析仪（LA8080）和杜马斯定氮仪完成代谢物定量。转基因材料通过农杆菌介导法转化，qPCR以ACTIN1为内参基因，数据统计分析采用GraphPad Prism 9完成。