《Journal of Hazardous Materials》：Rapid Methods for the Quantification of Ingested Nano-and Microplastics in Marine Fish by Imaging Flow Cytometry
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本研究优化了成像流式细胞术（IFC）用于快速、高精度量化生物样品中300 nm至30 μm的聚苯乙烯纳米微塑料（NMPs）。通过调整分散剂（1 μL·mL?1 Tween 20）和荧光染料（10 μL·mL?1 Nile Red）浓度，结合形态学校正因子和50 000事件采集，有效解决了传统方法检测限低、基质干扰及假阳性问题。实验验证表明该方法在鱼类组织中具有良好适用性，为生态风险评估提供了可靠技术支持。
王玉轩|刘帅|严颖|黄玉轩|吴如天|李永宇|王新红
中国福建省厦门大学环境与生态学院海洋环境科学国家重点实验室
摘要
对生物样本中纳米塑料（NMPs）和微塑料（MPs）的定量分析一直受到严格且不断变化的技术要求的限制。传统的分析技术通常受到固有的微米级检测限和低通量工作流程的约束，从而限制了它们对纳米塑料（NPs）进行准确快速计数的能力。在这项研究中，我们采用并优化了一种高通量分析方法，用于定量分析生物样本中的微塑料（MPs，即3微米聚苯乙烯（PS）球体）。系统优化表明，1微升·毫升^-1的吐温20能有效分散目标颗粒，而10微升·毫升^-1的尼罗红可以提供足够的荧光强度，同时不会产生过多的背景干扰。50000个颗粒的采集量确保了分析的稳定性和数据的可靠性。通过适当延长消化时间和减少组织用量，有效减轻了潜在的生物基质干扰，从而降低了残留有机物的含量。最后，结合基于形态的校正因子的校准曲线有效补偿了颗粒聚集偏差，显著提高了定量准确性。该方法通过鱼类中的控制暴露实验得到了验证，证明了其可行性和准确性，为NMPs的生态风险评估提供了坚实的技术支持。
引言
微塑料（MPs）被定义为尺寸小于5毫米的合成聚合物颗粒，随着塑料排放量的增加，它们已成为全球关注的优先污染物（Thompson等人，2009年；Lebreton和Andrady，2019年）。其中，聚苯乙烯纳米颗粒（PS NPs）（一种不可生物降解的石油基塑料（Kayan和Kayan，2023年））尤其令人担忧，因为它们不仅会在环境中持续存在，还会通过破碎和气溶胶化导致空气污染，并对海洋生物和生态系统造成急性毒性（Florance等人，2022年；Maione等人，2023年；Fan等人，2024年）。PS是一种由乙烯基基团连接到苯环上的合成芳香族聚合物，由单体苯乙烯制成。PS的开链结构如图S1所示。这种简单而稳定的结构赋予了PS显著的化学抗性、低密度和较差的生物降解性，这些特性使其在海洋环境中持续存在。PS还广泛用于包装、一次性器具和绝缘材料，因此成为水生系统中的常见污染物。鉴于其在环境中的普遍存在及其分解为MPs的倾向，PS是研究MPs和NMPs环境行为和毒理效应的理想模型聚合物。尽管其他聚合物，如聚乙烯（PE）和聚丙烯（PP）也在环境中普遍存在，但由于PS在其环境影响方面的充分记录和对其环境归趋的广泛先前研究，本研究选择了PS作为模型聚合物。已有大量文献记录了水生动物摄入PS的情况（Amelia等人，2021年；Zu等人，2023年；Fu等人，2024年），并且PS通过食物链传递给人类的可能性现在也被认为存在，这意味着可能对人类健康产生影响（Amelia等人，2021年；Ma等人，2023年；Lei等人，2024年）。最近的人体生物监测研究进一步强调了这种暴露途径的重要性。例如，Schwabl等人在来自不同地理区域的个体粪便样本中检测到了微塑料颗粒，表明这种暴露途径非常普遍（Schwabl等人，2019年）。同样，Ragusa等人在人类胎盘中发现了塑料碎片，表明它们可能跨越生物屏障。这引发了关于胎儿暴露的担忧（Ragusa等人，2021年）。此外，Leslie等人使用热解-气相色谱-质谱（Py-GC/MS）技术在人类血液中识别出了聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）和聚苯乙烯（PS）碎片，浓度范围为1.6至4.8微克·毫升^-1，这是首次获得关于系统性微塑料（MPs）存在的同行评审证据（Leslie等人，2022年）。这些发现共同支持了NMPs对人类健康风险的合理性，尽管剂量-反应关系和长期健康后果仍有待阐明。因此，量化水生生物中的MPs存在是评估生态风险的关键第一步（Abbasi，2021年）。
目前，仍需开发一种用于快速定量生物基质中NMPs的全面协议。常用的视觉检查、光谱方法和热分析技术各有局限性。视觉检查极易受到操作者主观性的影响且重复性差；对于小于100微米的颗粒，识别误差会随着颗粒尺寸的减小而呈指数级增加（Besseling等人，2014年）。传统的拉曼光谱和微傅里叶变换红外（micro-FTIR）光谱受到微米级检测限和低分析通量的限制（Primpke等人，2017年；Lusher等人，2020年；Sun等人，2021年；Torboli等人，2025年）。这阻碍了NPs的快速分析（Mintenig等人，2018年；Veerasingam等人，2020年；Li等人，2023年）。热技术如热解-气相色谱-质谱（Py-GC/MS）和热提取-脱附气相色谱-质谱（TED-GC/MS）可以用于识别聚合物并量化其质量，原则上没有尺寸限制。然而，高温热解会破坏颗粒的形态，从而消除与尺寸和数量相关的信息（L?der等人，2015年；Li等人，2021年）。每次运行只能分析毫克级的组织样本，而低丰度的NPs常常由于基质抑制效应而低于检测限。不同聚合物的热解产物重叠也可能导致假阳性结果（Faure等人，2015年）。传统的流式细胞术通过荧光染色可以快速计数150纳米至50微米的NMPs（Maes等人，2017年；Kaile等人，2020年；Ainé等人，2025年）。然而，常用的尼罗红（NR）染料由于其亲脂性容易聚集，这会产生沉淀物，其荧光信号与目标颗粒的荧光信号重叠，从而显著影响计数准确性。
为了弥合低通量光谱和破坏性热方法之间的差距，我们假设通过采用统计优化的门控和基于形态的校正来改进流式细胞术（IFC），可以同时提高NPs计数的速度和准确性。
流式细胞术（IFC）结合了实时统计门控和多参数形态测量分析，克服了传统方法的主要限制。在定义初始门控后，算法会根据采集的颗粒图像不断重新绘制门控边界，并创建包含面积、直径和长宽比等形状描述符的多维选择标准（Headland等人，2014年）。因此，可以区分尼罗红沉淀物和真正的塑料颗粒，基于图像的验证可以大大提高数据的可靠性。
尽管IFC的仪器购置和维护成本较高，但其图像分辨率仍低于扫描电子显微镜或原子力显微镜。这限制了对小于200纳米颗粒的形态表征。然而，选择IFC是因为其图像通道将非特异性结合事件从18%降低到3%，这是传统流式细胞术（FCM）未能解决的问题（Ainé等人，2025年）。其通量达到了每天60个样本（每次采集6分钟，准备时间1.5小时），远高于拉曼光谱（每个样本4小时）和Py-GC/MS（每个样本45分钟）（Ji等人，2025年）。
流式细胞术（IFC）结合了传统流式细胞术的高通量和类似于光学显微镜的空间分辨率。这使得能够同时检测荧光和验证每个事件的形态。在本研究中，我们利用这种双重能力来计数组织消化物中的300纳米至30微米聚苯乙烯（PS）颗粒，克服了拉曼或傅里叶变换红外（FT-IR）映射的尺寸和速度限制。ImageStreamX MK II可以在每个通过488纳米激光的颗粒上收集六张图像（明场和五个荧光通道）。实时门控软件随后提取12个形态描述符（例如面积、长宽比和实体度），用于区分真正的NMPs和尼罗红沉淀物或组织碎片（Headland等人，2014年）。因此，假阳性事件减少（Ainé等人，2025年）。通量达到每分钟5×10^4个颗粒，允许在6分钟内完成50000个事件的采集，且重合误差小于1%。尽管分辨率受到衍射限制，约为200纳米，但这里使用的300纳米PS微球仍可以清晰分辨，因为它们的尼罗红荧光占据了三个以上的相机像素。总体而言，IFC提供了生态毒理学筛查所需的速度，同时保持了监管质量数据所需的基于图像的准确性。
基于现有的流式细胞术（IFC），我们改进了分散剂的用量、染色化学方法和注射体积（Li等人，2023年）。我们还引入了基于形态的校正以消除基质干扰，并使用与基质匹配的校准验证了准确性。这项研究并没有引入新技术，而是提供了一种优化的高通量工作流程，并通过控制暴露实验证明了其在海洋鱼类中快速定量NMPs的实用性，为生态风险评估提供了现成的支持。
材料
选择吐温20（0.1% w·v^-1，Adamas，AR）作为分散剂，尼罗红（NR，Macklin，AR）作为荧光染料，选择300纳米PS（江苏智川科技有限公司，275-315纳米）、3微米PS（江苏智川科技有限公司，2.85-3.15微米）和30微米PS（江苏智川科技有限公司，28.5-31.5微米）微球作为替代目标颗粒（本研究中使用的所有PS颗粒均为单分散球形微珠）。支持试剂包括甲醇和超纯水
分散剂优化结果
在预分析优化步骤中，发现分散剂的浓度和化学性质决定了微塑料的单分散程度。为了区分与表面活性剂相关的效应和仪器产生的伪影，同时分析了添加了吐温20（0.1% w·v^-1，1-100微升·毫升^-1）的Milli-Q空白样本和相同体积的样本。两组样本产生了可重叠的点图特征（图1ii），每组样本都包含三个
结论
优化的流式细胞术协议（1微升·毫升^-1吐温20，10微升·毫升^-1尼罗红，50000个事件采集）现在可以在几分钟内定量鱼组织中的300纳米至30微米PS。每克组织中的映射（图8）提供了数值证据，表明纳米PS在组织颗粒中占主导地位，鳃部的颗粒数量为1.1×10^10个·克^-1，比其他任何器官高出两个数量级，而30微米PS的数量接近空白值，这验证了在鳃-肠道轴上的尺寸排除效应。
环境影响
本文研究的危险物质NMPs会渗透到水生食物网中。我们的流式细胞术协议突破了微米尺寸和通量限制，实现了生物体中纳米级别的快速定量。通过提供鱼体内300纳米至30微米PS的准确暴露数据，该方法直接支持危害识别、剂量-反应建模和早期预警监测，从而加速了自然生态系统中塑料污染的风险管理。
CRediT作者贡献声明
王玉轩：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原始草稿，方法学，调查，正式分析，数据管理。刘帅：数据管理。王新红：监督，方法学，资金获取，正式分析。吴如天：数据管理。李永宇：监督。严颖：数据管理。黄玉轩：数据管理。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文报告工作的竞争性财务利益或个人关系。
未引用的参考文献MEP_L_bib1;; 2021
致谢
作者感谢国家自然科学基金（U23A20145, 41961144011, 32071613）和中央高校基本科研业务费（20720240018）提供了进行这项研究的机会。
