《British Journal of Pharmacology》：Fenofibrate potentiates the therapeutic efficacy of EZH2 inhibitors on melanoma via TRIM21- and OTUD4-mediated EZH2 ubiquitination
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本文首次揭示经典降脂药非诺贝特可通过泛素-蛋白酶体途径促进EZH2蛋白降解，从而增强EZH2抑制剂在黑色素瘤中的抗肿瘤疗效。该研究发现了TRIM21（E3泛素连接酶）和OTUD4（去泛素化酶）是调控EZH2稳定性的关键介质，为克服实体瘤中EZH2靶向治疗耐药性提供了“老药新用”的创新性联合治疗策略，具有重要的临床转化潜力。
引言：黑色素瘤的治疗挑战与EZH2抑制剂的局限性
黑色素瘤是一种高度侵袭性的恶性肿瘤，其快速进展和转移特性为临床治疗带来了巨大挑战。脂质代谢重编程是其显著的代谢标志之一，在肿瘤进展中扮演着双重角色，既是能量来源和细胞膜结构骨架，也作为信号通路介质。表观遗传重编程，特别是组蛋白甲基转移酶EZH2（enhancer of zeste homologue 2）的异常表达和活化突变，在多种癌症中被发现并与肿瘤发生、转移及不良预后密切相关。EZH2是PRC2（Polycomb-repressive complex 2）的核心催化亚基，主要负责催化组蛋白H3第27位赖氨酸的三甲基化（H3K27me3），从而抑制基因转录。
尽管靶向EZH2的小分子抑制剂（如EPZ-6438和GSK-126）在部分血液肿瘤中展现出疗效，并已有药物（如他泽司他）获批上市，但在大多数实体瘤（包括黑色素瘤）中，其单药疗效有限。这种局限性部分归因于药物诱导的脂肪酸合成上调，更重要的是，现有EZH2抑制剂仅能抑制EZH2依赖H3K27me3的经典功能，而对EZH2不依赖H3K27me3的非经典功能（如非组蛋白底物甲基化、转录共激活等）无效。因此，同时靶向EZH2酶活性和蛋白表达的降解策略，有望成为更有效的抗肿瘤方法。
另一方面，非诺贝特作为一种自1975年即投入临床使用的口服降脂药，其通过抑制HMG-CoA还原酶降低胆固醇合成，疗效和安全性明确。近年来，越来越多的体内外研究表明，非诺贝特在多种肿瘤类型中可能具有降脂作用之外的抗肿瘤特性，但其在黑色素瘤中的作用及机制尚不明确。
非诺贝特增强EZH2抑制剂的抗肿瘤疗效
研究团队首先观察到，EZH2抑制剂（GSK-126和EPZ-6438）处理黑色素瘤细胞后，会显著增加细胞内的中性脂质含量，提示脂质代谢变化可能与疗效受限相关。基于此，他们筛选了临床批准的降脂药，以寻找能够增强EZH2抑制剂疗效的候选药物，结果发现非诺贝特能够显著增强EZH2抑制的抗肿瘤效果。
在体外细胞模型和3D肿瘤球体培养实验中，非诺贝特与EZH2抑制剂联合使用时，显示出比单药更强的抑制细胞增殖和破坏肿瘤球体结构的能力。体内小鼠皮下移植瘤模型进一步证实了这种协同作用：与单用EZH2抑制剂EPZ-6438或非诺贝特相比，联合治疗能更有效地抑制B16F10（小鼠黑色素瘤）和A375（人黑色素瘤）细胞的肿瘤生长，且未引起明显的肝肾功能损伤等急性毒性。值得注意的是，非诺贝特的活性代谢物非诺贝特酸并未显示出同等强度的抗癌作用，提示非诺贝特在黑色素瘤中的作用可能独立于其经典的、通过PPAR-α介导的降脂途径。
非诺贝特通过下调EZH2蛋白表达抑制黑色素瘤生长
机制探究发现，非诺贝特处理可显著下调黑色素瘤细胞中EZH2的蛋白水平，对H3K27me3水平的影响则相对温和。更重要的是，非诺贝特与EZH2抑制剂联用导致了EZH2和H3K27me3水平的双重显著下降。这一发现表明，非诺贝特可能通过同时影响EZH2的蛋白表达（非经典功能）和与抑制剂协同抑制其剩余酶活性（经典功能），来实现更强的抗肿瘤效应。功能回复实验证实，在黑色素瘤细胞中过表达EZH2，可以部分逆转非诺贝特诱导的生长抑制。此外，非诺贝特对EZH2的下调作用不依赖于其经典的PPAR-α受体激活途径，因为敲低PPAR-α或用其抑制剂GW6471处理，均不能阻断非诺贝特对EZH2蛋白水平的降低。
非诺贝特通过蛋白酶体途径调控EZH2稳定性
为了阐明非诺贝特下调EZH2的具体机制，研究人员检测了mRNA和蛋白水平的变化。结果显示，非诺贝特处理并未改变EZH2的mRNA水平，但显著缩短了EZH2蛋白的半衰期，表明其作用发生在翻译后水平。进一步使用蛋白酶体抑制剂（MG-132, PSI）和自噬/溶酶体途径抑制剂（氯喹、3-甲基腺嘌呤等）进行实验，发现只有蛋白酶体抑制剂能够有效阻止非诺贝特诱导的EZH2降解。随后的泛素化分析证实，非诺贝特处理能够显著增加内源性和外源性EZH2的泛素化修饰水平。这些结果共同表明，非诺贝特通过促进EZH2的泛素化修饰，进而经由泛素-蛋白酶体途径（UPS）加速其降解，从而降低其蛋白稳定性。
TRIM21和OTUD4是非诺贝特诱导EZH2降解的关键调控因子
为了寻找介导这一过程的具体分子，研究团队利用免疫沉淀结合质谱分析，鉴定出与EZH2相互作用的E3泛素连接酶和去泛素化酶（DUB）。进一步的筛选和验证将目标锁定在E3泛素连接酶TRIM21（tripartite motif-containing protein 21）和去泛素化酶OTUD4（OTU deubiquitinase 4）上。研究发现，非诺贝特处理可上调TRIM21、下调OTUD4的表达水平。功能上，敲低TRIM21或过表达OTUD4，都能部分挽救非诺贝特引起的EZH2降解。免疫荧光和免疫共沉淀实验显示，非诺贝特增强了EZH2与TRIM21的相互作用，同时减弱了EZH2与OTUD4的相互作用。分子对接模拟也支持EZH2与TRIM21和OTUD4存在直接互作。在体内小鼠肿瘤组织中，同样观察到了非诺贝特处理后EZH2和OTUD4下调、TRIM21上调的现象。
深入的泛素化实验表明，敲低TRIM21或过表达OTUD4都能显著削弱非诺贝特诱导的EZH2泛素化。通过使用泛素突变体（K48R和K63R）研究发现，EZH2受到K48和K63位点泛素化的共同调控，其中K48位点介导的泛素化在非诺贝特诱导的EZH2降解中起主导作用。
TRIM21敲低和OTUD4回补可逆转非诺贝特的抑瘤作用
为了确认TRIM21和OTUD4在非诺贝特抗肿瘤效应中的功能，研究人员进行了细胞增殖和体内成瘤实验。在体外，敲低TRIM21或过表达OTUD4均可部分逆转非诺贝特对黑色素瘤细胞生长的抑制，而同时进行TRIM21敲低和OTUD4过表达则表现出更强的逆转效果。在裸鼠皮下移植瘤模型中得到了相似的结论：非诺贝特能显著抑制野生型A375细胞形成的肿瘤生长，但在TRIM21敲低和/或OTUD4过表达的肿瘤中，这种抑制作用被部分或完全抵消。这些结果有力地证明了非诺贝特至少部分地通过调控TRIM21/OTUD4-EZH2轴来发挥其抗黑色素瘤效应。
TRIM21、OTUD4和EZH2在黑色素瘤中的预后价值
临床相关性分析进一步支持了上述发现。利用黑色素瘤组织芯片进行多重免疫荧光分析发现，与癌旁正常组织相比，肿瘤组织中EZH2和OTUD4的蛋白水平显著升高，而TRIM21水平显著降低。TRIM21的表达与EZH2水平呈显著负相关。生存分析显示，EZH2高表达与患者较差的总生存期和无进展生存期相关。TCGA（The Cancer Genome Atlas）数据库的分析也提示，TRIM21低表达与黑色素瘤患者较差的总生存期相关。这些数据共同揭示了EZH2、OTUD4和TRIM21在黑色素瘤发生发展及预后中的重要作用，并提示非诺贝特联合EZH2抑制剂的疗法，可能尤其适用于TRIM21低表达、OTUD4高表达的黑色素瘤患者亚群。
讨论与结论：老药新用的创新策略
本研究系统阐明了非诺贝特这一经典降脂药在黑色素瘤治疗中的新角色和新机制。研究发现，非诺贝特能够不依赖于其降脂功能，通过上调E3泛素连接酶TRIM21、下调去泛素化酶OTUD4，促进EZH2蛋白发生K48连接为主的泛素化修饰，进而通过泛素-蛋白酶体途径被降解。这种对EZH2蛋白表达的“消除”策略，与现有EZH2抑制剂对其酶活性的“抑制”策略形成完美互补，实现了对EZH2经典与非经典功能的双重打击，从而在体外和体内模型中均显示出强大的协同抗肿瘤效果。
这项研究的意义在于多个方面：首先，它为解决实体瘤中EZH2靶向治疗疗效有限的难题提供了一种新颖且可快速临床转化的联合治疗方案。其次，它揭示了非诺贝特一个全新的、独立于PPAR-α的抗肿瘤作用机制，拓展了我们对这个“老药”的认知。再者，研究首次将OTUD4鉴定为EZH2的去泛素化酶，并阐明了TRIM21/OTUD4这一对“跷跷板”如何精细调控EZH2蛋白稳定性的新通路。最后，该策略避免了开发新型EZH2-PROTAC（蛋白降解靶向嵌合体）药物可能面临的大分子量、低生物利用度等挑战，充分利用了非诺贝特已确证的良好安全性，为“老药新用”在肿瘤精准治疗领域的应用提供了范例。
当然，研究也存在一些局限，例如非诺贝特可能还通过其他未知通路发挥作用，且对TRIM21/OTUD4的上游调控机制仍需进一步探索。但毋庸置疑，这项工作为将非诺贝特与EZH2抑制剂联合用于黑色素瘤等实体瘤的临床评估提供了坚实的科学依据，并为利用TRIM21/OTUD4表达水平作为预测性生物标志物来筛选潜在获益患者指明了方向。
