在肌萎缩侧索硬化症（ALS）患者中，对全血、血浆和脑脊液（CSF）中的线粒体DNA指标进行检测和分析

《Journal of the Neurological Sciences》：Profiling mitochondrial DNA indices across whole blood, plasma, and CSF in amyotrophic lateral sclerosis

本研究系统评估了肌萎缩侧索硬化症（ALS）患者全血、血浆及脑脊液中mtDNA D-loop/COX3比率，发现全血比率与功能状态及生存期相关，而血浆及脑脊液比率与疾病进展速度存在趋势性关联，为mtDNA生物标志物提供新证据。

　　

Jiongming Bai|Xinyuan Pang|Hongfen Wang|Ying Zhang|Yahui Zhu|Jiarui Zhao|Yifan Li|Mao Li|Xusheng Huang

中国天津南开大学医学院

摘要

背景

最近的研究越来越多地表明线粒体DNA（mtDNA）的变异与神经退行性疾病有关，但不同研究之间的发现并不一致。我们的目标是表征全血、血浆和脑脊液（CSF）中mtDNA的指标，并评估其临床相关性。

方法

我们招募了两个研究队列：（1）102名ALS患者的全血队列；（2）包括132名ALS患者和62名非神经退行性疾病的对照组的血浆和脑脊液（CSF）队列。选择D-loop和COX3区域作为代表性的mtDNA片段，而B2M作为核参考基因。定量分析使用基于SYBR Green的定量PCR技术进行。

结果

在全血中，较高的D-loop/COX3比率与更好的功能状态和更长的生存时间相关。在无细胞成分的样本中，ALS患者的CSF ccf-mtDNA标志物（D-loop和COX3）显著高于对照组，而血浆中的含量则没有显著差异。在ALS患者中，较高的ccf-mtDNA指数倾向于与更严重的疾病程度和更快的功能下降相关。此外，较高的血浆和CSF D-loop/COX3比率也显示出与疾病进展加速的边际趋势。

结论

本研究系统地表征了ALS患者全血、血浆和CSF样本中的mtDNA变异，为mtDNA在神经退行性疾病中的作用提供了新的见解。

引言

肌萎缩侧索硬化症（ALS）是一种进行性神经退行性疾病，其特征是运动神经元的选择性退化。临床上，ALS表现为逐渐加重的肢体无力、球部麻痹和呼吸困难，最终导致独立生活能力丧失、持续吞咽困难、呼吸衰竭和肺部感染[1]。中位生存期约为3-5年。然而，ALS的发病机制仍不清楚。已提出了多种机制，包括谷氨酸兴奋毒性、氧化应激、线粒体功能障碍、蛋白质错误折叠、星形胶质细胞稳态失衡、神经炎症和能量代谢障碍[2]。

线粒体是细胞中典型的能量产生器官。然而，在氧化磷酸化过程中不可避免地会产生活性氧（ROS）。当ROS的产生超过清除能力时，其积累会加剧线粒体功能障碍[3]。在细胞应激条件下，线粒体DNA（mtDNA）可以释放到细胞质或细胞外环境中。这一过程中涉及多种机制，包括线粒体外膜通透性的增加、线粒体通透性转换孔（mPTP）的开放，或者在极端情况下，细胞破裂[4]。mtDNA位于细胞质中的线粒体基质中。根据内共生理论，线粒体起源于古代细菌，并保留了一些结构特征。它们的基因组mtDNA含有丰富的未甲基化CpG基序[5]。因此，这些独特的结构特征使mtDNA不仅成为编码氧化磷酸化机制关键亚基的遗传来源，也成为典型的损伤相关分子模式（DAMP）[6]。

越来越多的证据表明，异常的线粒体功能和线粒体完整性受损促进了ALS的病理生理过程。在SOD1突变小鼠的研究中显示，受损的线粒体会以独立于mPTP的方式将mtDNA释放到细胞质中，导致神经元功能障碍和I型干扰素反应[7]。同样，TDP-43的病理变化也被报道会通过损害线粒体完整性和刺激mtDNA释放来引发炎症[8]。与这些实验结果一致，临床研究进一步表明，ALS患者比对照组积累了更高比例的mtDNA变异和缺失[9]、[10]、[11]。在最近的一项研究中，ALS患者的血清循环无细胞线粒体DNA（ccf-mtDNA）水平显著升高，并且这些水平与IL-6呈正相关[12]。

为了进一步探讨循环mtDNA在ALS中的作用和临床相关性，我们系统地量化了全血、血浆和脑脊液中的mtDNA含量和缺失指数，并评估了它们与临床结果的关联。据我们所知，这是首次系统地评估ALS患者外周和中枢 compartments中的mtDNA谱型，旨在为其诊断、预后和病理意义提供新的见解。

章节片段

参与者招募

本研究包括两个独立的散发性肌萎缩侧索硬化症（sALS）患者队列，这些患者分别在不同研究期间从中国人民解放军总医院第一医疗中心的神经科连续招募，彼此之间没有重叠。（1）全血队列：共纳入了102名2015年5月至2019年5月期间入院的sALS患者。在住院时提取全血DNA，并在-80°C下保存直至分析。

全血mtDNA相对拷贝数

我们根据先前建立的方法，对102名sALS患者的全血中的mtDNA相对拷贝数进行了半定量分析。具体来说，选择非编码区域D-loop（相对拷贝数）和编码区域COX3（相对拷贝数）作为mtDNA的代表，以B2M作为核参考基因。此外，还计算了D-loop/COX3比率，作为线粒体小链和大链之间相对不平衡的替代指标。

讨论

线粒体DNA（mtDNA）含量的变化与线粒体生物发生有关，可能反映线粒体功能状态的变化，因此被探索为疾病状态和预后的潜在生物标志物[22]。然而，关于帕金森病（PD）、阿尔茨海默病（AD）和ALS等神经退行性疾病的发现并不一致，甚至相互矛盾[10]、[23]、[24]。在本研究中，我们系统地评估了不同 compartments（全血和ccf-mtDNA）中的mtDNA指标。

CRediT作者贡献声明

Jiongming Bai：撰写——原始草稿、方法学设计、概念构思。Xinyuan Pang：研究、数据分析、数据管理。Hongfen Wang：研究、数据分析。Ying Zhang：数据可视化、数据分析。Yahui Zhu：数据验证、资源协调。Jiarui Zhao：软件开发、数据管理。Yifan Li：撰写——审稿与编辑、数据可视化。Mao Li：项目监督、项目管理。Xusheng Huang：撰写——审稿与编辑、项目监督、概念构思。

伦理批准和参与同意

本临床研究方案已获得中国人民解放军总医院第一医疗中心伦理委员会的批准（批准编号：S2024–405-01）。

资金

作者声明在准备本手稿期间未收到任何资金、资助或其他支持。

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

致谢

作者感谢所有参与和合作的研究人员。