一种新型的转基因报告基因小鼠品系，该品系产生的小细胞外囊泡源自星形胶质细胞，可用于研究体内细胞间的通讯机制

《Journal of Neuroscience Methods》：A novel transgenic reporter mouse line of astrocyte-derived small extracellular vesicles for investigating intercellular communication in vivo

小胶质细胞来源的外泌体在脑缺血后神经修复中的调控作用及其机制研究。采用诱导型转基因小鼠模型GFP-CD63，首次实现体内星形胶质细胞分泌的外泌体特异性追踪，发现缺血性脑卒中后外泌体介导的星胶-神经元通讯显著增强，通过上调神经元内吞作用促进突触可塑性重建。该方法突破传统体外分离技术局限，为中枢神经系统中外泌体信号传导研究提供新工具

　　

刘中武|张毅|凯珀·艾米|李彦峰|达德利·安德鲁·C.|乔普·迈克尔|张正刚

美国密歇根州底特律市亨利福特健康中心神经科

摘要

背景

小型细胞外囊泡（sEVs）在中枢神经系统中介细胞间通信，调节从稳态维持到损伤修复等一系列过程。尽管星形胶质细胞是大脑中sEVs的主要来源，但对其内源性和细胞特异性信号传导的体内研究在技术上仍具有挑战性。

新方法

为了解决这一限制，我们开发了一种新型的可诱导转基因报告基因小鼠品系GFAP-CD63-GFP，该品系能够特异性标记由星形胶质细胞产生的sEVs。该小鼠品系是通过将GFAP-CreERT2小鼠与CD63-emGFPloxP/stop/loxP小鼠杂交获得的。该系统可实现他莫昔芬诱导下的星形胶质细胞特异性表达GFP标记的CD63蛋白，而CD63是一种在sEVs中富集的四跨膜蛋白。该模型能够实现对体内星形胶质细胞来源的CD63阳性sEVs的可视化与定量分析。

结果

在他莫昔芬诱导后，大脑和脊髓中均检测到了强烈的GFP表达。免疫金透射电子显微镜进一步证实了神经元内存在GFP阳性的sEVs，这为星形胶质细胞向神经元传递囊泡提供了超微结构证据。作为概念验证，缺血性中风显著增加了同侧大脑半球和脊髓受损侧的星形胶质细胞来源的sEVs数量，并伴有神经元内吞作用的增强。

与现有方法的比较

目前的方法主要依赖于体外EV分离或非特异性膜染料。GFAP-CD63-GFP模型实现了细胞类型特异性、时间可控的、原位追踪星形胶质细胞来源的sEVs的功能。

结论

这些发现首次在体内证明了中风恢复期间星形胶质细胞向神经元的sEV通信增加。因此，GFAP-CD63-GFP报告基因小鼠为研究中枢神经系统（CNS）在生理和病理生理条件下的星形胶质细胞来源sEV信号传导提供了一个强大的平台。

引言

星形胶质细胞是中枢神经系统（CNS）中最丰富的胶质细胞类型，是神经血管单元的重要组成部分，在维持大脑稳态中发挥着关键作用。它们广泛的突起包裹着突触和血管，从而调节脑血流、神经传递和细胞外离子平衡（Ransom和Ransom，2012；Scemes等人，2000）。星形胶质细胞还支持神经元存活，促进神经突起的生长，并参与突触的形成和成熟（Qian等人，2016；Wang和Cynader，1999）。因此，星形胶质细胞的功能障碍会破坏CNS的完整性，导致神经元丢失、运动缺陷以及损伤后的恢复受损（Liu等人，2014；Pekny等人，1999；Schreiner等人，2015）。

除了这些传统的支持作用外，星形胶质细胞还积极参与双向的神经元-胶质细胞通信。虽然化学突触代表了一种“有线”的交互模式，但越来越多的证据强调了通过胶质转运蛋白释放和细胞外囊泡（EV）交换进行“无线”通信的重要性（Ikezu等人，2024；Nieves Torres和Lee，2023）。这种由EV介导的信号传导允许细胞间传递功能性蛋白质、脂质和核酸，从而在无直接物理接触的情况下协调神经回路的反应（Chen等人，2026；Valadi等人，2007）。

尽管在小鼠正常情况下微胶质细胞对大脑中的EV池也有显著贡献，但在中枢神经系统损伤后，星形胶质细胞来源的小型EVs（sEVs）会显著增加（Brenna等人，2020）。研究表明，星形胶质细胞来源的sEVs可以促进神经元存活（Datta Chaudhuri等人，2020），刺激培养神经元的树突棘和突触形成（Patel和Weaver，2021），促进缺血性大脑中的轴突和突触重塑（Edelstein和Smythies，2014），并改善中风后的功能恢复（Heras-Romero等人，2022）。然而，这些发现大多基于从培养的星形胶质细胞中收集的sEVs，可能无法准确反映体内的动态和/或内源性细胞间通信情况。

为了克服这些限制，我们开发了一种新型的可诱导转基因小鼠品系，该品系能够用绿色荧光蛋白（GFP）选择性标记星形胶质细胞来源的sEVs。该系统实现了星形胶质细胞sEVs的原位可视化，并可通过他莫昔芬诱导来控制标记时间。作为概念验证，我们利用该模型研究了缺血性中风后神经元对内源性星形胶质细胞来源sEVs的内吞作用。

章节片段

伦理批准

所有动物实验均获得了亨利福特医院机构动物护理和使用委员会的批准（方案编号1544），并遵循美国国立卫生研究院关于实验室动物护理和使用的指南。亨利福特医院的生物资源设施获得了国际实验室动物护理评估和认证协会（AAALAC）的认证，符合人道护理和使用标准。

GFAP-CD63-GFP报告基因小鼠品系的验证

为了在体内可视化内源性星形胶质细胞来源的sEVs，我们通过将GFAP-CreERT2小鼠与CD63-emGFPloxP/stop/loxP小鼠杂交，生成了一种可诱导的报告基因小鼠品系（GFAP-CD63-GFP）。在他莫昔芬处理后，中枢神经系统中尤其是大脑和脊髓的灰质区域以及海马体中检测到了强烈的GFP表达（图1A、B）。此外，在肝脏、肾脏、肺和脾脏等外周器官中也观察到少量GFP阳性细胞（2-E）。

讨论

在这项研究中，我们开发并验证了一种新型的可诱导转基因报告基因小鼠品系GFAP-CD63-GFP，该品系能够实现内源性星形胶质细胞来源sEVs的体内可视化。利用该模型，我们证明了星形胶质细胞通过sEVs与神经元之间的通信在生理条件下发生，并在中风恢复期间显著增强。该模型为解析中枢神经系统中的细胞类型特异性囊泡信号传导提供了一个强大的方法学平台。

GFAP-CD63-GFP系统

CRediT作者贡献声明

刘中武：撰写——原始草稿、研究设计、资金获取、数据分析、概念构思。李彦峰：研究设计、数据分析。张毅：研究设计、数据分析。凯珀·艾米：研究设计、方法学。迈克尔·乔普：撰写——审稿与编辑、概念构思。达德利·安德鲁·C：撰写——审稿与编辑、方法学。张正刚：撰写——审稿与编辑、概念构思。

资金来源

本工作得到了亨利福特健康中心内部资助（2024年，项目编号ZL）的支持。

利益冲突声明

所有作者均声明没有利益冲突。