利用ZZ-R 127衍生的FMDV非结构蛋白开发了一种基于天然抗原的Western blot方法，用于定性血清学检测，以支持DIVA（动物疾病监测和诊断）工作流程
《Journal of Virological Methods》：Development of a native-antigen Western blot using ZZ-R 127–derived FMDV non-structural proteins for qualitative serology to inform DIVA workflows.
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本研究开发了一种基于原生非结构蛋白（NSPs）的Western blot检测方法，用于DIVA框架内的血清学确诊。通过SDS-PAGE分离六种FMDV血清型（A、O、Asia-1）的NSPs，验证抗原与单克隆抗体共迁移及MAb标记特性。实验证实2C、3D和~25.8kDa的3AB前体是可靠诊断靶标，牛血清820316能有效区分感染与免疫动物。像素定量分析显示R2>0.91的稀释依赖性信号特征，但存在较大凝胶间变异，建议作为ELISA不确定结果的二级确认工具。
Fuat ?zy?rük|ünal Parlak|Can ?ok?al??kan|Santina Grazioli|Y?lmaz Ak?a
土耳其尚勒乌尔法省哈兰大学兽医学院病毒学系，邮编63200
摘要
本研究描述了一种Western blot（WB）检测方法的发展，该方法利用口蹄疫病毒（FMDV）感染的ZZ-R 127细胞裂解物中的天然非结构蛋白（NSPs）来支持在DIVA（区分感染动物和接种疫苗的动物）框架内的确认性血清学诊断。从代表A型、O型和Asia-1型的六种FMDV分离株中生成了天然抗原，并通过变性SDS-PAGE进行分离。通过重组抗原的共迁移和单克隆抗体（MAbs）的检测验证了抗原的身份。使用一种NSP阳性和一种NSP阴性的牛血清，该检测方法能够一致地识别出2C、3D蛋白以及一个约25.8 kDa的3AB相关前体蛋白作为最可靠的诊断靶标。虽然单克隆抗体分析证实了裂解物中存在2C蛋白，但其与多克隆血清无反应，表明其在血清学检测中的实用性有限。基于像素的定量分析显示，在凝胶中的信号强度随稀释度呈可预测的变化（对数-对数图上的R2 > 0.91），但凝胶间的变异性较大，因此更适合定性应用而非定量分析。在模拟感染的细胞裂解物和阴性血清中未检测到信号，进一步证明了方法的特异性。由于保留了免疫优势NSPs的天然加工环境，该平台非常适合作为第二级工具，用于判断接种疫苗人群中ELISA结果的不确定性。
章节摘录
引言
口蹄疫病毒（FMDV）属于疱疹病毒属（Aphthovirus），属于icornaviridae科，是一种传染性强的反刍动物疾病，会导致严重的经济损失，包括生产损失、动物扑杀和国际贸易限制（Grubman & Baxt, 2004）。有效监测并及时区分感染动物和接种疫苗的动物（DIVA）对于疾病控制以及实现无口蹄疫状态至关重要。
牛血清和伦理批准
选择了两种具有明确NSP抗体状态的牛血清，用于评估其反应性和背景情况。血清820316是在临床确诊口蹄疫后50天从一只15个月大的泽西牛犊中采集的，该牛犊表现出典型的口腔水泡病变（无足部病变）。该牛犊已接种了两剂灭活FMDV疫苗，最近一剂接种于样本采集前180天，并在兽医监督下的设施中饲养。
检测条件优化和凝胶内线性
为了确定最佳工作条件并评估分析性能，我们首先使用恒定Ag1负载量，对单克隆抗体3C7（抗2C）进行了20倍稀释系列（1:100至1:76,800）的检测。在大约1:19,200的稀释度范围内仍可观察到明显的2C蛋白条带（图1A）。在这个代表性实验中，像素强度与稀释度在对数-对数尺度上呈线性关系（R2 = 0.09118；图1B），表明在较宽的动态范围内信号减弱是可预测的。
讨论
本研究的主要目标是开发并技术上验证一种基于天然抗原的Western blot平台，利用ZZ-R 127细胞裂解物来支持DIVA框架内的确认性血清学诊断。该方法通过特异性检测天然NSPs（特别是2C、3D蛋白及其3AB相关前体）成功地区分了FMDV感染动物和接种疫苗的动物。特异性通过未检测到非目标信号得到了证实。
结论
基于天然抗原的Western blot技术在检测FMDV NSP抗体方面是可行且具有生物学意义的。通过保留抗原环境和自然加工中间体，该方法能够一致地识别出免疫优势靶标（2C、3D蛋白）以及一个约25.8 kDa的3AB相关中间体。作为ELISA之后的第二级确认工具，该平台有助于判断ELISA结果的不确定性，提高病例分类的准确性，并支持疫苗效果的评估。
未引用参考文献
(O’Donnell等人，2001)
资助
本研究得到了土耳其农业研究与发展总局（TAGEM）和FMD研究所（安卡拉）的支持，项目编号为TAGEM/HSGYAD/13/A02/902/18。
CRediT作者贡献声明
Fuat ?zy?rük：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化、方法学设计、实验设计、数据分析、概念化。ünal Parlak：撰写 – 审稿与编辑、数据可视化、数据分析。Can ?ok?al??kan：撰写 – 审稿与编辑、资源协调、实验设计、数据管理。Santina Grazioli：撰写 – 审稿与编辑、资源协调、实验设计。Y?lmaz Ak?a：撰写 – 审稿与编辑、项目监督。致谢
作者感谢意大利布雷西亚IZSLER研究所的Emilio Brocchi博士慷慨提供用于鉴定FMDV-NSPs的单克隆抗体。我们衷心感谢已故的Bernd Haas博士（德国Friedrich-Loeffler研究所）为病毒培养提供的ZZ-R 127细胞系。同时，我们也感谢土耳其安卡拉FMD研究所的管理层提供的基础设施、生物安全设施和技术支持。
