Sirtuin 1 通过蛋白质-蛋白质相互作用抑制 NLRP3 炎症小体的激活

《Life Sciences》：Sirtuin 1 inhibits NLRP3 inflammasome activation through protein-protein interaction

SIRT1通过N-末端与NLRP3的PYD/NBD域直接相互作用，抑制ASC寡聚化及炎症小体组装，其去乙酰化活性并非必需。

何立春|曾宜玲|洪晓坚|陈宇馨|杨清春|程宜宁|涂宇婷|邵爱宁|蔡佩珍|李意洁|王熙豪|洪世元|蔡耀生

台湾高雄市义修大学医学院

摘要

Sirtuin 1（SIRT1）已知通过抑制NF-κB来抑制NLRP3炎性小体的激活，但其在炎性小体组装中的作用尚不清楚。在这里，我们使用HEK293T重组系统证明，SIRT1在炎性小体激活时会直接与NLRP3相互作用并共定位。SIRT1的共表达会破坏NLRP3与ASC的相互作用以及NLRP3依赖的ASC寡聚化，从而阻碍炎性小体的组装。共免疫沉淀分析显示，SIRT1的N端对其结合和抑制功能至关重要，而其去乙酰化活性则不是必需的。这些发现表明，SIRT1主要通过蛋白质-蛋白质相互作用而非去乙酰化来抑制NLRP3炎性小体的激活，这为针对NLRP3-SIRT1相互作用相关的疾病提供了潜在的治疗靶点。

引言

炎性小体是先天免疫系统的一部分，其中NLRP3（含有pyrin结构域3的核苷酸结合寡聚化结构域（NOD）样受体）炎性小体是研究最为透彻的[1]。NLRP3炎性小体的异常激活与多种疾病有关，使其成为潜在的治疗靶点[2]。NLRP3炎性小体的经典激活分为两个步骤[3]：第一步刺激（信号1），通常是病原体相关分子模式（PAMP）或损伤相关分子模式（DAMP），触发启动阶段；该阶段涉及核因子κB（NF-κB）通路的激活，导致NLRP3、pro-IL-1β和pro-IL-18的转录增加。第二步刺激（信号2），如钾离子外流，随后引发激活阶段；该阶段包括NLRP3的寡聚化、ASC（含有caspase招募结构域CARD的凋亡相关斑点蛋白）的招募和寡聚化，以及NLRP3、ASC和procaspase-1组装成功能性蛋白复合体。一旦组装完成，NLRP3炎性小体就成为procaspase-1自催化切割为活性caspase-1的平台，进而将IL-1β和IL-18加工为其成熟形式[3]。

NLRP3蛋白包含三个结构域：N端的pyrin结构域（PYD）、中间的核苷酸结合结构域（NBD）和C端的亮氨酸富集重复（LRR）结构域。PYD和NBD都参与NLRP3的寡聚化；然而，只有寡聚化后的NLRP3的PYD通过同型PYD-PYD相互作用招募ASC[4],[5]。另一方面，LRR结构域在缺乏PAMP或DAMP的情况下起到维持NLRP3处于非活性状态的作用[6]。NLRP3炎性小体的失调激活与多种疾病相关，一种潜在的治疗干预方法是破坏炎性小体组装所必需的蛋白质-蛋白质相互作用。

Sirtuin 1（SIRT1）是一种依赖烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD⁺）的III类组蛋白去乙酰化酶[7]。最初因其与长寿相关的作用而被发现[8]，现在已知SIRT1参与多种蛋白质的去乙酰化，并与多种代谢途径和疾病过程有关[9],[10]。人类SIRT1包含一个保守的催化核心，两侧分别有N端和C端结构域[11]。催化核心由一个NAD⁺结合亚域、一个螺旋模块和一个Zn²⁺结合模块组成[12]。催化核心中功能关键且高度保守的残基（如H363Y）的点突变会使其去乙酰化活性丧失[13]。N端和C端结构域也调节催化活性[12],[14],[15],[16],[17]。SIRT1的激活依赖于NAD⁺，它从底物中接受一个乙酰基，生成去乙酰化的蛋白质nicotinamide（NAM）和2′-O-乙酰-ADP-ribose[9]。NAM可作为SIRT1的抑制剂，并通过回收途径重新转化为NAD⁺[18]。白藜芦醇（RSV）是一种天然SIRT1激活剂，可增强SIRT1对NAD⁺及其乙酰化底物的亲和力[19]；相反，EX-527是一种合成的SIRT1拮抗剂，能有效抑制其活性[20]。

SIRT1具有抗炎特性[10]。最广泛研究的机制是它对NF-κB的RelA/p65亚基在Lys310位的去乙酰化，从而抑制NF-κB的转录活性[21],[22]。鉴于NF-κB信号传导对NLRP3炎性小体的经典激活至关重要，因此SIRT1通过抑制NF-κB通路来部分抑制NLRP3炎性小体活性并不令人意外[23],[24],[25]。然而，尽管越来越多的研究表明SIRT1负调节NLRP3炎性小体并具有治疗相关疾病的潜力，但SIRT1介导的NLRP3炎性小体抑制的详细分子机制尚未完全阐明。例如，尽管NLRP3的活性受其乙酰化状态调控，但目前尚无研究将SIRT1确定为NLRP3乙酰化的调节因子[26],[27],[28]。在本研究中，我们发现了SIRT1的N端与NLRP3的PYD和NBD结构域之间的直接蛋白质-蛋白质相互作用。这种相互作用干扰了NLRP3与ASC的结合以及NLRP3依赖的ASC寡聚化。值得注意的是，SIRT1-NLRP3相互作用伴随着NLRP3的去乙酰化；然而，缺乏催化活性的SIRT1突变体仍能抑制NLRP3炎性小体的激活。这些结果表明，SIRT1通过直接的蛋白质-蛋白质相互作用调节NLRP3炎性小体，与其去乙酰化活性无关。

材料

化学品（包括NLRP3炎性小体激活剂和抑制剂）购自Sigma-Aldrich/Merck。细胞培养试剂如抗生素、RPMI-1640、Dulbecco's Modified Eagle Medium（DMEM）和胎牛血清（FBS）购自Thermo Fisher Scientific。本研究中使用的质粒列于表S1中。本研究中使用的抗体列于表S2中。

C57BL/6J小鼠来自台湾国家生物模型中心。

腹膜巨噬细胞的分离和处理

分离了小鼠腹膜巨噬细胞

SIRT1抑制NLRP3炎性小体的激活

我们首先研究了SIRT1活性对小鼠腹膜巨噬细胞中NLRP3炎性小体激活的影响。使用SIRT1激活剂RSV处理后，NLRP3炎性小体的激活以剂量依赖的方式减弱，在RSV浓度为50 μM时，caspase-1的成熟和IL-1β的产生受到最显著的抑制（图1A）。无论NLRP3炎性小体是由nigericin、alum还是monosodium urate诱导的，RSV处理都能有效抑制其激活。

讨论与结论

多项研究表明，SIRT1是NLRP3炎性小体的负调节因子，主要通过降低NLRP3的表达来实现[35],[36],[37],[38]。这种效应通常归因于SIRT1对RelA/p65亚基的去乙酰化，进而抑制对NLRP3转录至关重要的NF-κB信号传导[21],[35]。最近的研究还表明，sirtuins可能通过直接去乙酰化NLRP3本身来抑制炎性小体的激活[27]。在这里，我们...

CRediT作者贡献声明

何立春：撰写——审阅与编辑，撰写——初稿，数据可视化，项目管理，资金获取。曾宜玲：研究，数据分析，概念化。洪晓坚：数据验证，研究。陈宇馨：数据验证，研究。杨清春：方法学。程宜宁：数据可视化，数据分析。涂宇婷：数据可视化，研究，数据分析。邵爱宁：数据验证。蔡佩珍：

写作过程中使用生成式AI和AI辅助技术的声明

在准备本工作时，作者使用ChatGPT-4o Mini来提高手稿的可读性和语言表达。作者随后根据需要审阅和编辑了内容，并对最终版本的手稿负全责。

资金来源

本工作得到了国家科学技术委员会（NSTC，编号为113-2314-B-214-008、110-2320-B-006-017-MY3、111-2320-B-006-022-MY3和113-2320-B-006-039-MY3）以及国立成功大学和E-DA医院研究项目（编号为NCKUEDA11302和NCKUEDA11402）的资助。

利益冲突声明

作者声明没有已知的利益冲突或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

我们感谢国立成功大学医院临床医学研究中心的核心实验室、国立成功大学医学院的核心研究实验室，以及台湾国家科学技术委员会生物技术核心设施计划的生物成像核心设施的支持。