《LWT》：Catechol derivatives interact with lysozyme: correlation of noncovalent interactions and antibacterial properties
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本研究针对溶菌酶对革兰氏阴性菌抗菌效果有限的瓶颈，创新性地探究了酯化修饰的儿茶酚衍生物1-MCG与溶菌酶的非共价相互作用机制。研究发现，相比于咖啡酸，1-MCG与溶菌酶的结合展现出独特的多位点、高亲和力特性，并能有效维持溶菌酶活性构象。两者形成的复合物能显著提升对多种革兰氏阳性与阴性菌的抗菌活性，为开发新型高效抗菌蛋白-配体复合物提供了新策略。
在人体对抗病原微生物入侵的防御前线，溶菌酶是一种广泛分布于体液中的天然抗菌卫士。它能够像一把精确的分子剪刀，水解细菌细胞壁中肽聚糖的β-1,4糖苷键，导致细菌“破壁”而亡。然而，这位卫士也有其“盲区”。革兰氏阳性菌的细胞壁富含肽聚糖，是溶菌酶的主要攻击目标；而革兰氏阴性菌的外膜如同一层坚固的铠甲，其下仅有一层薄薄的肽聚糖，这使得溶菌酶对它们的抑制效果大打折扣。与此同时，咖啡酸等天然儿茶酚类化合物虽展现出抗菌、抗氧化等多种生物活性，但其水溶性差、稳定性不佳等问题限制了其应用潜力。能否将天然抗菌蛋白与活性小分子“强强联合”，创造出“1+1>2”的协同抗菌效应，成为了研究人员探索的新方向。
为了解决上述问题，来自福建医科大学的研究团队在《LWT》期刊上发表论文，深入研究了两种儿茶酚衍生物——咖啡酸和其酯化衍生物1-单咖啡酰甘油与溶菌酶之间的非共价相互作用，并系统评估了所形成复合物的抗菌性能。他们发现，1-MCG凭借其甘油侧链，与溶菌酶形成了更为复杂和稳定的结合模式，这种独特的相互作用不仅没有破坏溶菌酶的活性结构，反而使其与溶菌酶组成的“复合抗菌剂”对包括大肠杆菌和金黄色葡萄球菌在内的多种细菌展现出显著增强的抑制和杀灭能力。这项研究为设计新型的、具有协同增效作用的抗菌复合物提供了坚实的理论依据和全新的思路。
研究人员主要运用了多光谱学分析、计算机模拟和抗菌活性测定三大类关键技术方法。多光谱学技术包括荧光光谱、紫外-可见光谱、圆二色谱和同步荧光光谱，用以实时监测和分析蛋白质与小分子结合过程中的动态变化、结合常数、作用力类型以及蛋白质二级结构的改变。计算机模拟技术则涵盖了分子对接和Multiwfn量子化学分析，前者用于预测小分子在蛋白质活性口袋中的最优结合位点和模式，后者则从原子层面量化并可视化相互作用强度与类型。抗菌活性测定采用了标准的微量肉汤稀释法，测定了复合物对三种革兰氏阳性菌和三种革兰氏阴性菌的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度，用于评价其实际抗菌效果。研究所用的六种细菌菌株由华南理工大学食品科学与工程系的许真波教授惠赠。
研究结果
3.1. 荧光淬灭机制
通过荧光淬灭实验，研究人员发现CA和1-MCG均能有效淬灭溶菌酶的内源荧光，且该过程是自发进行的。Stern-Volmer分析表明，CA与溶菌酶的相互作用以静态淬灭为主，而1-MCG则同时涉及静态和动态淬灭过程。结合常数Ka计算显示，两者与溶菌酶均具有高亲和力，但CA的亲和力略高于1-MCG。热力学参数分析指出，疏水作用是驱动复合物形成的主要力量。荧光共振能量转移计算进一步揭示，1-MCG与溶菌酶的结合距离略大于CA，提示其结合可能不那么紧密，更易于在需要时释放。
3.2. 溶菌酶构象变化
紫外-可见吸收光谱和同步荧光光谱结果显示，与1-MCG结合后，溶菌酶中色氨酸和酪氨酸残基周围的微环境亲水性增强，表明这些残基更多地暴露在蛋白质表面。圆二色谱分析证实，尽管α-螺旋含量略有下降，但溶菌酶整体的二级结构得以保持，其活性形态基本稳定。
3.3. 分子对接
分子对接模拟从原子层面揭示了结合细节。CA主要通过与溶菌酶活性口袋中的Gln 57和Trp 63形成氢键结合，而1-MCG则能与包括Asp 48、Trp 62、Trp 63、Asn 59在内的更多氨基酸残基形成8个氢键和1个疏水相互作用。这表明1-MCG在溶菌酶的疏水口袋中结合得更深入、位点更多元，其甘油侧链增加了额外的相互作用点。
3.4. Multiwfn分析
利用Multiwfn进行的独立梯度模型分析量化并可视化了相互作用。散射图显示1-MCG与溶菌酶之间的δginter峰值更高，表明其原子间相互作用更强。等值面图直观展示出1-MCG的酚羟基、酯基和甘油骨架均参与了与溶菌酶的结合，形成了更广泛的相互作用网络，包括氢键、范德华力和疏水作用。
3.5. 最小抑菌浓度与最小杀菌浓度
抗菌实验是研究的落脚点。单独使用时，1-MCG的抗菌活性就优于CA。当两者分别与溶菌酶形成复合物后，抗菌效能得到进一步放大。尤为重要的是，1-MCG-溶菌酶复合物表现出卓越的协同抗菌效果。与单独的溶菌酶或1-MCG相比，该复合物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度降低了50%至75%。此外，它对所有测试的六种细菌均展现出比CA-溶菌酶复合物更优的抑制和杀灭能力。
研究结论与意义
本研究系统阐明了两者间的非共价相互作用主要由疏水作用和氢键驱动，且是一个自发的、吸热的过程。尽管1-MCG与溶菌酶的结合亲和力略低于CA，但其通过甘油侧链实现了多位点、更强度的结合，并引起了溶菌酶活性口袋区域更显著的亲水性变化，这可能有利于其与细菌细胞壁的接触。分子模拟从结构上证实了1-MCG在溶菌酶疏水口袋中更广泛的锚定作用。
最关键的发现在于功能验证：1-MCG-溶菌酶复合物展现出了显著的协同抗菌效应。研究者提出了一种合理的协同作用机制：1-MCG可能率先破坏细菌细胞膜的结构完整性，削弱其屏障功能；此举为溶菌酶“扫清障碍”，使其更容易接近并水解内层的肽聚糖，从而产生级联放大的抗菌效果。这种“先破膜，后破壁”的策略，巧妙绕过了溶菌酶对革兰氏阴性菌作用不足的短板。
该研究的意义深远。它不仅详细揭示了特定儿茶酚衍生物与一种重要抗菌蛋白的相互作用图谱，更示范了一种通过理性设计“蛋白质-配体”复合物来增强现有抗菌物质效能的策略。将天然活性分子与天然抗菌蛋白耦合，为开发新型、低毒、不易产生耐药性的抗菌制剂提供了全新的思路，在食品防腐、医疗抗菌材料及局部感染治疗等领域具有广阔的应用前景。然而，该协同机制的时间序列和精确作用过程仍需进一步在体和更复杂的临床菌株中进行验证，这也是未来研究的重要方向。
