《Marine Environmental Research》：Field-adaptable RAA–CRISPR/LbCas12a assay for specific detection of
Karenia brevis in natural seawater
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有害藻华检测中，基于重组酶辅助扩增（RAA）与CRISPR-Cas12a联用技术建立了短裸甲藻特异性快速检测方法。通过靶向ITS区域设计引物和向导RNA，结合荧光（FQ）与侧流读数（FB-LFD），可在5-20分钟内完成海水样本中单个细胞的检测，且无交叉反应。该方法成功验证于福建连江2024年5月采集的天然海水样本，为我国近海有害藻华监测提供了便携式解决方案。
卢王|尹生吴|魏英|孙炳顺|林振月|魏王|陈建明
中国福建海洋大学福州海洋研究所海洋生物多样性保护与可持续利用重点实验室，福州350108
摘要
Karenia属物种分布广泛，可引发有害藻华（HABs），对沿海生态系统、水产养殖和人类健康构成威胁。Karenia brevis（K. brevis）是一种产生短裸甲藻毒素的物种，尤其值得关注。尽管中国大陆尚未报告大规模的藻华事件，但K. brevis可能以低浓度存在，并与其他形态相似的Karenia物种共存，因此需要通过物种水平进行检测。本文结合重组酶辅助扩增（RAA）技术和 clustered regularly interspaced short palindromic repeats（CRISPR）-Lachnospiraceae 细菌 Cas12a（LbCas12a）技术，建立了一种快速检测K. brevis的方法。RAA引物和 crRNA 是根据高度变异的内部转录间隔区（ITS）设计的，用于区分K. brevis与其他近缘Karenia物种。检测结果包括使用荧光报告基因（FQ）的荧光检测，以及使用 FAM–生物素报告基因（FB）和侧向流动检测条（LFD）的侧向流动检测。简单的快速裂解 DNA 准备方法适用于该技术，支持野外操作，随后可通过便携式荧光仪或 FB-LFD 进行读数。FQ 格式还支持在实验室仪器上进行动态监测。该方法能够检测到每微升 5.9 × 103 个 ITS 质粒拷贝，甚至低至每毫升 1 个细胞（每个反应输入 0.1 个细胞当量），且不会与九种非目标藻类发生交叉反应。2024 年 5 月在福建连江采集的自然有害藻华水样通过该方法和克隆/系统发育分析检测均为阴性，但在加入K. brevis细胞后呈阳性，表明海水对检测结果影响较小。该平台能够灵敏且特异性地检测K. brevis，并可轻松扩展用于其他近缘Karenia物种。
引言
有害藻华（HABs）是指沿海水域中微藻的突然大量繁殖，会对生态和经济造成严重影响（Berdalet 等，2016）。在这些事件中，Karenia属尤为引人注目，因为许多Karenia物种会产生强效毒素，可杀死鱼类和其他海洋生物。过去二十年里，全球变暖和沿海富营养化导致Karenia藻华的频率、规模和地理分布范围增加（Cen 等，2024），这凸显了快速进行物种水平检测的必要性（Jinek 等，2012）。Karenia brevis（K. brevis）是研究最深入的Karenia成员之一，它产生的短裸甲藻毒素（brevetoxin）可导致鱼类和贝类大量死亡，并引起人类呼吸系统刺激（Flaherty 和 Landsberg，2011；Rolton 等，2014）。在墨西哥湾和佛罗里达州，K. brevis藻华几乎每年都会发生，造成了巨大的经济损失（Sengco，2009；Hoagland 等，2014）。虽然中国尚未明确记录由K. brevis引起的大型藻华事件，但有报告指出K. brevis出现在广东沿海和长江口（Qian 等，2000；Wang 等，2006），并且中国福建大亚湾的K. brevis菌株提供了其存在的分子证据（Shen 等，2021）。同时，东亚地区的许多藻华事件涉及多种Karenia物种的共存或优势生长（Lin 等，2020；Iwataki 等，2022），包括K. mikimotoi、K. papilionacea和K. brevisulcata等形态相似的物种在不同地区被误认为是K. brevis（Al-Kandari 等，2011；Yamaguchi 等，2016）。中国尤其频繁发生具有重大经济影响的K. mikimotoi藻华（Gu 等，2022），2005 至 2018 年间共报告了约 100 起事件（Lü 等，2019），K. papilionacea也在香港（Yeung 等，2005）和厦门港（Luo 等，2018）被记录到。鉴于中国沿海不断出现新的有害藻华物种，继续监测如K. brevis这样的罕见但潜在有害物种，并将其与其他共存的Karenia物种区分开来仍然十分重要。
传统上，有害藻华的鉴定主要依赖光学显微镜观察，这依赖于细微的形态特征，因此需要经验丰富的分类学家。这种方法耗时且依赖实验室条件，当需要区分密切相关的物种时容易出错（Toldrà 等，2020）。为了解决这些问题，人们开发了一系列替代方法（Liu 等，2022）。基于色素或“细胞色素”的方法，如高效液相色谱（HPLC）、吸收光谱分析和荧光光谱分析，已被用于快速高通量筛选藻类群落。然而，这些方法需要专用仪器，通常只能区分主要藻类群，而无法区分单个有害藻华物种，限制了其在常规物种水平监测中的应用（Liu 等，2022）。基于免疫测定的方法，包括免疫荧光、免疫传感和酶联免疫吸附测定（ELISA），无需 DNA 提取，且操作快速（Meek 和 Van Dolah，2016；Liu 等，2022），但实现物种水平特异性通常需要单克隆抗体，这些抗体成本较高且不易获得。基于核酸的方法，尤其是聚合酶链反应（PCR）、定量 PCR（qPCR）和多重 PCR，具有更高的灵敏度和特异性，已被广泛应用于有害藻华物种的检测（Yuan 等，2012；Eckford-Soper 和 Daugbjerg，2015；Sun 等，2019），但由于依赖热循环仪、洁净实验室和熟练人员，限制了其在野外常规监测中的使用。
等温扩增技术部分解决了这些问题，因为它们在恒定温度下运行，可以快速完成（Toldrà 等，2019）。环介导等温扩增（LAMP）已被用于K. mikimotoi的检测（Wang 等，2020），超分支滚环扩增（HRCA）已被用于Heterosigma akashiwo的检测（Zhang 等，2018），RPA-LFD 已被用于Chattonella marina的检测（Zhang 等，2022）。然而，这些方法在大规模或野外应用中存在实际限制（Liu 等，2022）。LAMP 需要 4–6 个引物和复杂的引物设计，HRCA 需要多个步骤和较长的反应时间，商业 RPA 试剂盒相对昂贵。重组酶辅助扩增（RAA）是一种基于 RPA 的方法，在 37-42 °C 下运行，仅使用两个引物，扩增时间在 5–20 分钟内，且比 RPA 更便宜，适用于有害藻华监测（Lobato 和 O’Sullivan，2018；Lü 等，2011；Xu 等，2022）。然而，与其他等温方法一样，RAA 也可能产生非特异性产物，如果未添加序列确认步骤，则可能导致假阳性（Jiang 等，2023；Mao 等，2023）。因此，将等温扩增与第二个高特异性识别系统结合使用是必要的。
基于 clustered regularly interspaced short palindromic repeats（CRISPR）的诊断方法满足了这一需求。CRISPR/Cas 系统由 Cas 效应基因和 CRISPR 间隔序列阵列组成（Jinek 等，2012），几种 Cas 效应蛋白，特别是 Lachnospiraceae 细菌 Cas12a（LbCas12a，原名 Cpf1），可以通过引导 RNA 程序化以识别目标 DNA 序列，然后通过旁路（trans）活性切割附近的单链 DNA 报告基因（Chen 等，2018；Duran-Vinet 等，2021）。由于 Cas12a 对错配特别敏感，尤其是在 PAM 和 PAM 附近区域，它可以区分非常接近的序列（Kleinstiver 等，2016）。DETECTR（DNA Endonuclease-Targeted CRISPR Trans Reporter）结合了等温扩增和 Cas12a 以及荧光或侧向流动报告基因，已成功应用于病原体检测、单核苷酸多态性（SNP）鉴定和抗菌素耐药性分析（Chen 等，2018；Sun 等，2021）。将相同原理应用于有害藻华物种具有吸引力，因为许多近缘Karenia物种在 ITS 或 rDNA 上仅相差几个碱基。
近年来，基于核酸的有害藻华诊断技术快速发展，将等温扩增与 CRISPR/Cas12 转录切割结合，实现了灵敏且特异性的检测，并可通过荧光和/或侧向流动读数显示结果。这类 CRISPR 辅助等温技术已用于包括甲藻（如Karenia mikimotoi（Wang 等，2023）和Karlodinium veneficum（Wang 等，2025）在内的有害藻类目标，以及其他藻类（Yu 等，2025），并且越来越多地考虑便携性以便在现场进行水样检测（Hasan 等，2025）。基于这些进展以及我们之前针对其他有害藻类的研究（Wang 等，2023；Wang 等，2025），我们将 RAA 与 CRISPR/LbCas12a 结合，建立了一种快速、特异性强且适用于野外的K. brevis检测方法。我们从 ITS 区域设计了 RAA 引物和 crRNA，该区域因其高度的种间变异性和短而易于扩增的片段而被广泛用于藻类物种鉴定（Engesmo 等，2018；Wang 等，2023；Wang 等，2023；Han 等，2022）。我们不仅使用质粒 DNA，还使用天然和添加了K. brevis的海水进行了系统评估，使用粗略的快速裂解提取物简化了样品制备过程，这是 CRISPR 基础有害藻华检测中常被忽视的步骤。结果表明，RAA–CRISPR/LbCas12a 系统能够在低浓度下检测到K. brevis，并将其与其他共存的Karenia物种区分开来，适用于中国沿海水域有害藻华的早期预警。
藻类培养与维护
本研究中使用的微藻（表 1），包括K. brevis和其他物种，来自中国厦门大学的海洋细菌和藻类收集中心，或由我们的团队从自然样本中分离得到。所有培养物均在高压灭菌后的 3 μm 过滤海水中（盐度 30 PSU）培养，并添加了 L1 培养基营养物质，具体方法参照先前描述（Wang 等，2014）。培养条件包括保持 20 ± 2 °C 的温度。
RAA 引物选择和 crRNA 优化
为了确定合适的引物和 crRNA 目标位点，我们将K. brevis（克隆 607_1）的 ITS 序列与从 NCBI BLAST 中获得的 100 个同源 ITS 序列进行了比对，这些序列代表多种Karenia物种（K. brevis、K. mikimotoi、K. selliformis、K. brevisulcata、K. papilionacea、K. hui、K. sp. GM94GAB、K. sp. CCMP429），以及密切相关的Gymnodinium sp. Chile_53/16、Asterodinium gracile 和 Gymnodinium aureolum。去除了物种内的冗余变异，保留了一个代表性序列。
讨论
涉及Karenia的藻华在中国沿海水域已成为反复出现的问题，单一事件中可能同时存在多种Karenia物种。这种共存情况使得即使是对K. brevis等罕见物种的鉴定也变得至关重要（Gu 等，2022；Wang 等，2023）。尽管迄今为止在中国仅检测到低浓度的K. brevis，但其与其他Karenia物种的形态相似性使得仅依靠显微镜难以进行可靠鉴定。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
CRediT 作者贡献声明
陈建明：撰写 – 审稿与编辑。卢王：撰写 – 审稿与编辑、监督、项目管理、方法学设计、概念构建。魏英：撰写 – 审稿与编辑。尹生吴：撰写 – 初稿撰写、可视化、数据分析、数据管理。林振月：撰写 – 审稿与编辑。孙炳顺：撰写 – 审稿与编辑。魏王：撰写 – 审稿与编辑未引用参考文献
Guillou 等，2002；Haywood 等，2007；Lobato 和 O’Sullivan，2018；Lü 等，2010；Wang 等，2023；Zhen 等，2009。数据可用性
本研究生成或分析的所有数据均包含在本文中。
资助
本工作得到了CERI R&D项目（资助号 YF241041）和福建省海洋服务与高质量渔业发展专项基金项目（FJHYF-L-2025-07-002）对 LW 的支持。此外，还得到了福建省科学技术计划（2024N0028）对 ZY Lin 的支持，以及福州市科学技术规划项目（2025-SG-013）对 WW 的支持。利益冲突声明
? 作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
