《Mitochondrial Communications》：Mitochondrial NMNAT3 reduces amyloid aggregates in
Drosophila and alters the amyloid processing in the 3xTgAD mouse
编辑推荐：
本研究针对阿尔茨海默病（AD）中淀粉样蛋白（Aβ）聚集的病理机制，通过果蝇和小鼠模型探讨线粒体定位的烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶3（NMNAT3）的神经保护作用。研究发现NMNAT3在果蝇眼中显著减少Aβ聚集，但在3xTg-AD小鼠中虽改变APP加工过程（增加CTF/Aβ42水平），却未影响斑块数量。该研究揭示了NMNAT3的分子伴侣功能在不同模型中的差异性，为靶向线粒体的AD治疗策略提供了新视角。
在探索阿尔茨海默病治疗策略的漫长征程中，科学家们一直致力于寻找能够遏制大脑中异常蛋白聚集的关键分子。阿尔茨海默病作为一种进行性神经退行性疾病，其两大典型病理特征——细胞内神经原纤维缠结和细胞外淀粉样斑块——如同大脑中的“垃圾堆积”，最终导致神经元死亡和认知功能衰退。尽管已有一些药物能够缓解症状，但能够从根本上延缓或阻止疾病进展的有效疗法依然匮乏。近年来，一种名为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）的细胞内重要辅酶及其合成通路引起了广泛关注，因为研究发现其在神经保护、能量代谢和抵抗细胞应激中扮演着核心角色。
在NAD+的合成过程中，烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶（NMNAT）是必不可少的催化剂。有趣的是，哺乳动物体内存在三种NMNAT同工酶（NMNAT1、NMNAT2和NMNAT3），它们分布在细胞的不同区域，其中NMNAT3主要定位于线粒体。线粒体作为细胞的“能量工厂”，其功能紊乱与阿尔茨海默病的发病密切相关。更引人注目的是，此前的研究表明，NMNAT酶（尤其是果蝇的dNMNAT和哺乳动物的NMNAT3）除了其经典的酶活性外，还具有“分子伴侣”功能，能够像“蛋白质质检员”一样，防止包括Tau和淀粉样蛋白β（Aβ）在内的多种错误折叠蛋白形成有毒聚集体。那么，特异性靶向线粒体的NMNAT3，是否能在活体动物模型中真正发挥对抗阿尔茨海默病关键病理的作用？其保护机制是依赖于提升NAD+水平，还是其分子伴侣功能？这些问题成为了本研究试图解答的核心科学问题。
为了回答上述问题，由Milena Pinto领导的研究团队在《Mitochondrial Communications》上发表了一项跨物种研究。他们巧妙地利用了两个经典的阿尔茨海默病动物模型：在果蝇的发育光感受器神经元中表达人源淀粉样前体蛋白（APP）和β-分泌酶（BACE1）以模拟Aβ产生和聚集；同时，他们在更为复杂的3xTg-AD转基因小鼠（同时携带突变型APP、早老素1PSEN1和Tau蛋白）的大脑海马和皮层神经元中特异性过表达了NMNAT3。通过这种从简单到复杂的模型策略，研究人员旨在系统评估NMNAT3在体内对抗淀粉样蛋白病理的潜力和具体机制。
研究采用的关键技术方法
本研究综合运用了多种分子生物学、生物化学和组织学技术。在果蝇实验中，利用GMR-GAL4/UAS系统组织特异性表达目标基因，并通过蛋白质免疫印迹（Western blot）和免疫组织化学检测蛋白表达与聚集。在小鼠模型中，通过杂交育种获得AD-NMNAT3转基因小鼠，利用Western blot、酶联免疫吸附试验（ELISA）定量分析APP加工产物（如C末端片段CTF和Aβ42）及聚集态Aβ水平，并通过免疫组化进行淀粉样斑块的立体学计数。此外，研究还通过连续偶联酶法测定NMNAT3的酶活性，并通过比色法检测NAD/NADH水平。所有小鼠实验均使用雌性3xTg-AD小鼠，并遵循了动物伦理规范。
研究结果
2.1. 果蝇光感受器中APP和BACE1的表达导致淀粉样聚集体的时空特异性积累
研究人员首先在果蝇眼中成功构建了淀粉样蛋白病理模型。Western blot结果证实，表达人源APP和BACE1后，能检测到完整的APP（APP-FL）及其被BACE1切割后产生的C末端片段（CTF），表明β-分泌酶活性正常。免疫染色显示，APP聚集具有时间和位置依赖性：在羽化后30天（30 DAE），细胞体层（Lamina Cortex, Lc）出现小的点状聚集体；到了90 DAE，Lc层的小聚集体减少，但在突触层（Lamina, L）出现了大的聚集体。
2.2. 不同的Nmnat同工酶均能减少光感受器中的淀粉样斑块积累，其中hNMNAT1和hNMNAT3效果最强
接下来，研究人员在表达APP的果蝇中共同表达了不同的NMNAT同工酶（包括果蝇dNMNAT、人源的hNMNAT1、hNMNAT2、hNMNAT3，以及作为对照的线粒体绿色荧光蛋白mGFP）。结果表明，所有NMNAT同工酶的共表达均能减少淀粉样聚集体的总数。具体而言，在30 DAE时，dNMNAT、hNMNAT1和hNMNAT3能显著减少Lc层的小聚集体数量；在90 DAE时，所有同工酶均能减少L层的大聚集体数量，其中hNMNAT1和hNMNAT3展现出最强的抑制聚集效果。
2.3. AD-NMNAT3小鼠模型的构建与表征
为了在哺乳动物模型中验证NMNAT3的作用，研究团队培育了在forebrain神经元中特异性过表达小鼠NMNAT3（mNMNAT3-FLAG）的3xTg-AD转基因小鼠（AD-NMNAT3小鼠）。实验证实，NMNAT3蛋白成功表达，并特异性定位于神经元（与NeuN共标）的线粒体内（与线粒体标志物COX1共定位）。酶活实验证明，过表达的NMNAT3-FLAG蛋白具有催化活性，能够合成NAD。然而，无论是大脑总匀浆还是线粒体富集组分中，过表达NMNAT3并未显著提升NAD或NAD/NADH的水平。同时，研究人员发现过表达NMNAT3导致了皮层和海马中线粒体质量标志物（VDAC, SDHA）的轻微增加，但对神经元和胶质细胞的标志物水平没有影响。
2.4. 淀粉样病理加工过程
对小鼠大脑的分析显示，过表达NMNAT3并不影响总APP（APP-FL）的蛋白水平。然而，它显著改变了APP的加工过程：在12月龄和18月龄的AD-NMNAT3小鼠海马组织，以及18月龄的皮层组织中，β-分泌酶切割APP产生的C末端片段（CTF）与其前体APP的比值（CTF/APP）显著升高，提示β-分泌酶活性可能增强。进一步通过ELISA检测发现，18月龄AD-NMNAT3小鼠皮层和海马中的Aβ42水平以及聚集形式的Aβ42含量均显著高于对照组。
2.5. 淀粉样蛋白聚集
尽管上述生化分析显示Aβ42的产生和聚集增加，但令人意外的是，通过免疫组织化学对脑切片进行淀粉样斑块计数和体积测量发现，过表达NMNAT3并未改变12月龄或18月龄AD小鼠海马区淀粉样斑块的数量和大小。点印迹（DOT blot）分析进一步证实，18月龄AD-NMNAT3小鼠脑组织不溶性淀粉样蛋白含量确实更高。
研究结论与讨论
本研究得出了一个看似矛盾但极具启发性的结论：线粒体NMNAT3在不同阿尔茨海默病模型中对淀粉样蛋白病理的影响存在显著差异。在果蝇眼中，NMNAT3过表达能有效减少APP聚集体的形成；然而在3xTg-AD小鼠脑中，虽然它改变了APP的加工过程，导致更多的Aβ42产生和聚集，却并未影响最终形成的淀粉样斑块的负荷。
这种差异可能源于多种因素。首先，模型系统的根本差异是关键。果蝇模型是通过转基因直接表达人源APP和BACE1，Aβ的产生和聚集更多发生在细胞内，且果蝇缺乏哺乳动物体内促进细胞外斑块形成的复杂环境（如载脂蛋白E、特定的细胞外基质成分）。而小鼠模型模拟的是更接近人类的疾病进展，Aβ主要在细胞外空间聚集形成斑块。定位于线粒体（主要位于细胞内）的NMNAT3，其分子伴侣功能可能更容易接触到果蝇模型中细胞内累积的Aβ，从而有效抑制其聚集；但在小鼠模型中，NMNAT3难以直接干预细胞外已形成的斑块。
其次，关于NMNAT3的作用机制，本研究强有力的证据表明，其神经保护作用可能主要归功于其分子伴侣活性，而非通过提升NAD+水平。尽管过表达的NMNAT3具有酶活性，但研究人员并未检测到大脑NAD+水平的升高。这可能是由于底物（NMN）限制、NAD+的快速消耗，或是线粒体本身可以通过其他途径（如转运体SLC25A51）输入NAD+，使得NMNAT3的合成功能显得不那么关键。最近的研究也认为，线粒体NMNAT3更重要的作用可能是缓冲细胞内NAD+的波动，而非单纯地提升其稳态水平。
综上所述，这项研究揭示了NMNAT3，特别是其线粒体亚型，在调控阿尔茨海默病关键蛋白病理中的复杂角色。它强调了在评估潜在治疗靶点时，考虑其亚细胞定位、作用机制（酶活性与非酶活性的分子伴侣功能）以及不同模型系统局限性的重要性。研究结果提示，针对NMNAT3分子伴侣活性的开发，或许为阿尔茨海默病的治疗提供了新的思路，但同时也警示，其在复杂哺乳动物大脑环境中的效果需要更加审慎的评估。未来的研究需要进一步解析NMNAT3在不同细胞区室中的作用，以及如何优化其递送策略，使其保护功能能够有效作用于疾病的关键病理位点。
