《NanoImpact》：Sample preparation now (2025) and then: Lessons from 13?years of nanomaterial regulatory safety testing
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纳米材料安全测试中样本制备与剂量评估指南（GSPD）第三版（2025）整合近十年研究成果，涵盖物理化学表征、哺乳动物与环境毒理测试，强调介质组成对纳米材料行为的影响，新增表面亲疏性评估，完善剂量估算的虚拟工具应用，并强化与OECD测试方法互认机制及欧盟可持续化学政策衔接。
Kirsten Rasmussen|Richard Handy|Ivana Vinkovi? Vr?ek|Hubert Rauscher|Mar Gonzalez|Tommaso Serchi
欧洲委员会，联合研究中心（JRC），意大利伊斯普拉
摘要 经济合作与发展组织（OECD）调整或新开发了部分OECD测试指南（TGs）和指导文件（GDs），以应对纳米材料的监管测试需求。“制造纳米材料安全测试的样品制备和剂量测定指南”（GSPD）是其中的关键文件。该指南介绍了样品制备的通用方法，而具体的测试指南和指导文件通常会包含针对特定测试的信息。GSPD涵盖了用于测试纳米材料物理和化学性质、哺乳动物和环境影响以及环境归趋的样品制备方法。2025年发布的第三版GSPD整合了过去十年在样品制备和剂量测定方面取得的重大进展，包括从中获得的经验教训。GSPD指出目前尚无通用的样品制备协议，并强调了对剂量测定和有效剂量的更深入理解。如今，剂量估算依赖于“计算机模拟”（in silico）工具。在所有测试中，介质组成是决定纳米材料行为的关键因素，应予以系统考虑。用于物理和化学性质测试的样品制备新增了一个评估指标——疏水性。GSPD反映了在环境研究中制备纳米材料样品的关键实际问题上的共识。关于“体外”（in vitro）测试的样品制备信息是全新的，而关于哺乳动物毒性测试的样品制备信息也体现了知识的飞跃。术语表也得到了大幅扩展。本文概述了更新后的GSPD中的新内容。
引言 自2006年以来，经济合作与发展组织（OECD）通过“制造纳米材料工作组”（WPMN）推动了全球对纳米材料安全性的理解（Rasmussen等人，2016年；Rasmussen等人，2025年）。通过“关于制造纳米材料和其他先进材料的安全性系列报告”，OECD分享了在纳米材料安全性所有监管方面的进展。OECD测试指南计划（TGP）为化学品的监管测试制定了测试指南（TGs）。TGP建立在数据相互认可（MAD）协议的基础上（OECD，1981年）。MAD确保使用TGs结合良好实验室规范（GLP）获得的结果在成员国之间得到认可，从而节省资源并支持化学品安全方法的国际化协调。此外，OECD还制定了指导文件（GDs），这些文件反映了最佳实践的共识，尽管它们不在MAD的覆盖范围内。
虽然TGs和GDs构成了化学品监管测试的基石，但将其应用于纳米材料时往往需要额外的考虑和调整。TGs得到了OECD统一模板（OTHs，
https://www.oecd.org/en/topics/sub-issues/assessment-of-chemicals/harmonised-templates.html ）的支持，同时也针对纳米材料测试开发了专门的OHTs，例如OHTs 101至113（物理和化学性质）和401（TG 318，OECD，2017c）。只有少数TGs经过验证适用于纳米材料，这凸显了需要定制方法和特定于纳米材料的指导的必要性。为此，WPMN承担了确保TGs及其对应的MAD适用于纳米材料监管测试的重要任务（Rasmussen等人，2019年）。此外，为了应对纳米材料测试的关键特征，WPMN制定了专注于纳米材料独特性质和要求的指导文件。这一努力的重要成果是2012年发布的《制造纳米材料安全测试的样品制备和剂量测定指南》（GSPD-2012）（OECD，2012年），该指南基于2010年发布的初步指导说明，旨在支持OECD的测试和评估计划（Rasmussen等人，2016年）。与通常只包含特定测试样品制备指导的TGs和GDs不同，GSPD提供了通用、跨领域的建议，指导如何按照可控、一致、相关和可靠的程序准备纳米材料样品，以实现可重复的结果。其重要性体现在它被纳入了OECD理事会关于制造纳米材料安全测试和评估的具有法律约束力的建议中（OECD，2013年和2017年）。此外，纳米材料的样品制备方法可能因下游应用（如物理和化学表征或安全性评估）而大相径庭，有时还需要考虑纳米材料特有的因素。
鉴于GSPD-2012的重要性以及自2012年以来在纳米材料测试和制备方面的科学进展，WPMN于2020年启动了GSPD的更新工作。这项工作由欧洲委员会的联合研究中心（JRC）和卢森堡科学技术研究院（LIST）共同领导，普利茅斯大学（英国）、克罗地亚医学研究与职业健康研究所以及来自OECD成员国的多位专家参与了其中。更新后的GSPD（以下简称GSPD-2025）于2025年发布，反映了纳米材料用于监管测试的最新技术水平，包括物理和化学表征、哺乳动物和环境影响测试以及环境归趋（OECD，2025）。
GSPD-2025指出，纳米材料的测试样品制备通常比一般化学品更为复杂，因为纳米材料往往需要分散在液体介质中，并且会受到聚集和沉淀等动力学过程的影响（OECD，2019）。这常常导致系统不稳定，需要添加添加剂来提高稳定性。然而，添加剂的使用也会改变纳米材料的反应性，可能导致难以解释的毒性结果，并影响对目标物种的推断。分散稳定性受多种因素影响，如颗粒浓度、表面性质、介质组成（pH值、离子强度）、天然或合成添加剂和稳定剂的存在（例如蛋白质、有机物），以及所选制备协议（OECD，2012年；OECD，2017b）。这些相互作用强烈影响纳米材料的行为及其潜在的（生态）毒理学/毒理学效应。
GSPD-2025进一步强调，在纳米材料测试过程中可能会出现误差（例如，由于有毒杂质、纳米材料储存不当、分散不理想、干扰检测试剂，或忽视间接效应（例如检测过程中的营养耗竭）等原因导致的错误测试结果）。再加上缺乏普遍认可的测试方法，这些挑战增加了结果不可重复或不准确的风险（Petersen，2015年）。
在准备毒理学测试样品时，必须考虑上述所有因素，相关的剂量测定也需要谨慎处理。例如，虽然在高风险评估等情况下使用极高剂量有时是有用的，但应谨慎使用。系统过载会显著改变纳米材料的行为，可能导致不可靠的结果。在生态毒理学中，浓度高于100 μg/mL通常被认为是安全的。但在其他类型的实验（如哺乳动物细胞培养）中使用相同的浓度范围时需要谨慎。目前尚无关于最大可施用剂量的共识，因此分析人员应逐例评估在不过度改变作用机制或生物系统反应性的情况下可施用的最高剂量。
除了科学作用外，GSPD-2025还强化了OECD的MAD框架，确保纳米材料测试结果在各国得到认可。通过与OECD TGs和GDs的对齐，它支持纳米材料安全评估的全球化协调，特别是那些为纳米材料量身定制或开发的指南（Rasmussen等人，2025年）。此外，GSPD-2025指出，已经付出了大量努力将纳米材料分类为不同的子类别（Rumble等人，2015年；Gaillard等人，2019年）。参考这种分类系统可以帮助确定纳米材料所属的（子）类别，从而简化样品制备和剂量调整。更新后的GSPD结合了物理和化学表征、环境和毒理学测试方面的样品制备和剂量测定发现，以及2012年至2025年间纳米材料监管测试的经验教训。在欧洲背景下，更新后的指南还与“安全可持续设计”（Safe and Sustainable by Design，SSbD）等正在进行的项目相衔接（Garmendia Aguirre等人，2025a；Garmendia Aguirre等人，2025b），从而为欧盟绿色协议和化学品可持续性战略的政策优先事项做出贡献。
本文分析了GSPD-2025相对于GSPD-2012的主要变化，总结了从中获得的经验教训，并探讨了对纳米材料监管测试的更广泛影响。
部分摘录 第三版样品制备和剂量测定指南 GSPD-2025包含七个部分和一个术语表；前三部分提供了关于测试过程中样品制备和剂量测定的一般信息，而后四部分分别针对物理和化学表征、环境影响、环境归趋和毒理学效应等特定指标的样品制备方法进行了说明。GSPD-2012的结构类似，也涵盖了样品制备的一般问题和所有相关内容
范围 两版GSPD都以强调样品制备在纳米材料测试中关键作用的一般介绍开始。GSPD-2025进一步说明了更新的理由，并将其置于越来越多被确认适用于纳米材料的OECD TGs和GDs的背景下。重要的是，引言还明确了指南的范围（框1），明确指出GSPD-2025主要关注
GSPD-2025中的更新内容 两版GSPD都提供了术语、剂量测量考虑因素、样品制备和剂量测定常见问题的通用信息。表1比较了两个版本中这些部分的内容，并突出了主要差异。
为物理和化学表征准备纳米材料样品 GSPD-2025中关于“准备用于物理和化学性质测试的纳米材料样品”的指南强调，可靠的表征至关重要，因为纳米材料的潜在毒理学效应与其物理化学性质密切相关。可靠的数据集也有助于对相同或相似纳米材料的研究进行有意义的比较。然而，样品制备程序是变异性的重要来源，可能会显著影响测试结果
为生态毒性研究、降解、转化和积累研究准备暴露介质中的纳米材料样品 GSPD-2025中关于“为生态毒性研究准备暴露介质中的纳米材料样品”的指南基本保持了与GSPD-2012相同的结构和子标题，但内容已根据十年的科学进展进行了大幅更新。GSPD-2025指出，现在已有专门针对纳米材料的TGs和GDs。例如，TG 318和GD 318（OECD，2017c；OECD，2021）提供了评估分散稳定性的方法，而OECD（2022）概述了
用于毒性测试的纳米材料样品制备和剂量测定 与GSPD-2012相比，GSPD-2025中关于“用于毒性测试的纳米材料样品制备和剂量测定”的指南进行了全面重组和修订，以反映科学进展（表3）。新的GSPD-2025结构首先介绍了用于“体外”和“体内”测试的样品制备和剂量测定的常见问题，随后分为两个具体部分：一部分关于
经验总结、结论与展望 GSPD-2025的内容相比GSPD-2012有了全面更新。更新的内容总结了过去13年的经验教训，特别是在纳米材料测试制备方面的理解取得了显著进步。在测试纳米材料时，剂量和剂量测定是关键考虑因素，应在准备样品时就加以考虑。此外，还列出了准备测试样品的一般注意事项。接下来是主要经验教训
Kirsten Rasmussen： 监督、方法论、研究、概念化、撰写——审阅与编辑、初稿撰写。Richard Handy： 方法论、研究、撰写——审阅与编辑。Ivana Vinkovi? Vr?ek： 方法论、研究、撰写——审阅与编辑。Hubert Rauscher： 方法论、研究、撰写——审阅与编辑、初稿撰写。Mar Gonzalez： 方法论、研究、撰写——审阅与编辑。Tommaso Serchi： 方法论、研究
联合研究中心由欧盟的研究与创新资助计划“地平线欧洲”（Horizon Europe）提供资金支持。
未引用参考文献 El Medina-Reyes等人，2020年
利益冲突声明 作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。
致谢 作者感谢OECD WPMN的专家们在GSPD开发过程中所做出的贡献。
