《Journal of Biochemical and Molecular Toxicology》：Irigenin Modulates BL-Induced Pyroptosis in Retinal Pigment Epithelial Cells Through p38 MAPK and NFκB Pathways
ABSTRACT
年龄相关性黄斑变性（AMD）是老年人视力丧失的主要原因，与炎症过程密切相关。本研究旨在阐明鸢尾素（一种具有抗炎、抗氧化、抗凋亡和抗癌活性的异黄酮）对蓝光（BL）诱导的N-视黄基-N-视黄烯乙醇胺（A2E）负载的人成人视网膜色素上皮（A2E负载的ARPE-19）细胞损伤的保护作用。鸢尾素预处理以浓度依赖的方式显著减轻了BL诱导的细胞毒性并保留了上皮屏障功能。此外，鸢尾素显著抑制了促炎细胞因子的表达和NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NLRP3）炎症小体的激活，表现为NLRP3、ASC、gasdermin D（GSDMD）的全长和裂解形式的表达降低，以及caspase-1活性降低。进一步的机制分析表明，鸢尾素有效抑制了核因子κB（NFκB）信号通路的激活，表现为NFκB和NFκB抑制剂（IκB）α的磷酸化、NFκB的激活和核转位减少，以及p38丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）的磷酸化降低。这些发现强调了鸢尾素通过调节炎症和焦亡通路来改善BL诱导的视网膜色素上皮细胞损伤的潜力，表明其在预防AMD方面具有治疗价值。
1 Introduction
AMD是老年人失明的主要原因，其特征是进行性且不可逆的视力丧失。AMD的发病机制涉及衰老、环境因素和遗传易感性的复杂相互作用，其中慢性炎症和氧化应激是其进展的关键驱动因素。除了经典的凋亡和坏死途径外，最近的证据表明，焦亡（一种炎症驱动的程序性细胞死亡形式）对AMD的进展至关重要。视网膜光感受器是启动视觉过程所必需的，但对BL损伤高度敏感，这种损伤被A2E（视网膜更新过程中积累在视网膜色素上皮（RPE）细胞中的一种光毒性副产物）加剧。BL照射通过A2E光活化和其他细胞毒性化合物触发活性氧（ROS）的形成，增加氧化应激并引发炎症小体激活。这启动了炎症级联反应，导致焦亡，这是一种由先天免疫扰动调节的裂解性细胞死亡机制，其特征是释放IL-1β等促炎介质。尽管焦亡最初是抵御病原体的防御机制，但其慢性激活会促进持续炎症，这与AMD的关系日益密切。最近的证据表明，焦亡增加了RPE细胞对光氧化损伤的易感性，促进变性，并强调了其作为AMD发病机制中重要驱动因素的潜在作用。
由于AMD发病机制的多因素性，各种天然化合物正在被研究其减轻炎症、氧化应激和视网膜变性的潜力。这些药物，特别是植物异黄酮，已通过调节炎症通路、减少氧化损伤和减弱细胞死亡过程显示出保护作用。其中，鸢尾素是一种从射干（Belamcanda chinensis(L.) DC.）中分离出来的异黄酮，因其强大的抗炎和抗氧化特性而脱颖而出，先前已在癌症、糖尿病并发症、炎症性疾病和心脏损伤模型中显示出益处。尽管有这些见解，鸢尾素在视网膜疾病如AMD中的潜力仍然 largely uncharted。本研究通过应用A2E负载的ARPE-19细胞，使用了干性AMD的体外模型。该模型有效模拟了萎缩性AMD早期阶段RPE细胞所经历的氧化和炎症应激。然而，必须承认，该模型不能充分复制与湿性AMD相关的病理性新生血管形成，因为它缺乏脉络膜内皮细胞和必要的血管生成刺激。因此，本研究的结果和解释仅限于干性AMD，不能外推至湿性AMD中与血管生成相关的机制。本研究旨在探索鸢尾素在减轻BL诱导的炎症和焦亡方面的潜力。
2 Materials and Methods
2.1 Cell Culture
人视网膜色素上皮细胞系ARPE-19购自台湾食品工业发展研究所的生物资源收藏与研究中心，并在添加了10%胎牛血清和抗生素的Dulbecco改良Eagle培养基中培养。
2.2 Drug Treatment and BL Exposure
细胞用20 μM A2E预处理24小时。预处理后，细胞与鸢尾素（12.5、25或50 μM）孵育1小时，然后暴露于BL照射（430 nm, 6000 lux）15分钟。光照后，细胞返回标准生长条件并孵育24小时。
2.3 Lactate Dehydrogenase Assay
使用市售检测试剂盒通过测量乳酸脱氢酶（LDH）释放来评估细胞毒性。处理后，从每个孔收集细胞培养上清液并转移到新的96孔板。加入LDH检测溶液后，样品在室温黑暗中孵育30分钟，随后用酶标仪在490 nm和680 nm测量吸光度。
2.4 Determination of Transepithelial Resistance
将细胞接种到具有可渗透膜（0.4 μm孔径）的transwell小室中，培养至形成融合单层。使用电阻仪测量跨上皮电阻（TEER）。每次测量前，电极在PBS中平衡以确保准确性。测量期间，将电极置于Transwell系统的顶室和底室中，记录电阻值。最终TEER值计算为每平方厘米的电阻（Ω·cm2），并针对背景膜电阻进行调整，将值标准化至基线以监测处理过程中屏障完整性的变化。
2.5 Griess Assay
处理后，收集培养上清液并转移到96孔板中，加入Griess试剂（由溶解在2.5%磷酸中的1%磺胺和0.1% N-(1-萘基)乙二胺二盐酸盐组成）。混合物在室温黑暗中孵育10分钟，随后用酶标仪在540 nm记录吸光度。
2.6 Nuclear Factor Kappa Beta Activity Measurements
使用NFκB转录因子检测试剂盒评估A2E负载的ARPE-19细胞中NFκB的激活。通过将细胞与透化缓冲液在4°C孵育10分钟和0.1% NP-40裂解缓冲液来制备核提取物。离心后，分离核部分，重悬于提取缓冲液，并在冰上放置30分钟。离心提取物，收集上清液进行分析。随后将核提取物与含有NFκB结合位点的寡核苷酸孵育。使用辣根过氧化物酶偶联抗体量化NFκB活性，并在450 nm测量吸光度。
2.7 Caspase-1 Activity Measurements
使用荧光法检测试剂盒按照制造商说明测量caspase-1活性。处理后，细胞在4°C的冰冷缓冲液中裂解1小时。使用Ac-Tyr-Val-Ala-Asp 7-氨基-4-三氟甲基香豆素（YVAD-AFC）作为底物检测caspase-1活性。使用酶标仪记录荧光信号（激发：400 nm，发射：505 nm）。
2.8 Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
使用商业酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒按照制造商方案测量IL-1β、IL-6和肿瘤坏死因子（TNF）-α水平。处理后，收集上清液并加载到抗细胞因子抗体包被的板上，在4°C孵育16小时。用含有0.05% Tween-20的磷酸盐缓冲盐水洗涤板三次，然后与生物素偶联的抗细胞因子抗体孵育1小时。在额外洗涤后，加入链霉亲和素-辣根过氧化物酶和3,3',5,5'-四甲基联苯胺底物溶液。用硫酸停止反应，并使用酶标仪在450 nm测量吸光度。
2.9 Western Blot Analysis
细胞在含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的放射免疫沉淀测定缓冲液中裂解以防止蛋白质降解。裂解物在4°C以12,000 rpm离心15分钟澄清，使用Bradford法测定所得蛋白质浓度。等量蛋白质上样到十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，并转移到聚偏二氟乙烯膜上。膜在室温下用5%脱脂牛奶封闭1小时，随后在4°C与一抗孵育过夜。应用辣根过氧化物酶偶联的二抗在室温下孵育1小时。一抗，包括iNOS、COX-2、β-肌动蛋白、NLRP3、ASC、GSDMDC1、p-NFκB、NFκB、p-IκB、p-p38和p38，购自Santa Cruz Biotechnology，二抗购自Jackson ImmunoResearch Laboratories。使用增强化学发光法显示蛋白质条带，并用化学发光成像仪成像。
2.10 Immunofluorescence
进行免疫荧光染色以可视化A2E负载的ARPE-19细胞中NFκB p65和cleaved GSDMD的细胞内定位。细胞处理后，用10%中性缓冲福尔马林固定，用0.1% Triton X-100透化，并在室温下用5%牛血清 albumin（BSA）封闭。随后样品在4°C与针对NFκB、p-NFκB、GSDMDC1和GSDMD-N的一抗孵育过夜。用PBS洗涤后，细胞在黑暗中与Cy3偶联的二抗（Affinipure山羊抗小鼠或抗兔IgG）孵育。用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI, 1 μg/mL）复染细胞核。使用Lionheart自动显微镜获取荧光图像。所有免疫荧光实验每组至少进行三个独立的生物学重复，并使用BioTek Gen5 Software定量荧光强度。
2.11 Statistical Analysis
所有数据表示为至少三个独立实验的平均值±标准差。使用单向方差分析评估组间差异。P值小于0.05被认为具有统计学显著性。
3 Results
3.1 Irigenin Attenuates BL-Induced Cytotoxicity in A2E-laden ARPE-19 Cells
测量LDH释放（细胞损伤的标志）以评估鸢尾素对A2E负载的ARPE-19细胞中BL诱导损伤的保护作用。暴露于BL 15分钟显著增加了LDH释放，表明细胞毒性。用鸢尾素预处理1小时以剂量依赖的方式减少了LDH释放。在25和50 μM浓度下，LDH水平显著降低，证明鸢尾素有效减轻了BL诱导的细胞毒性。
3.2 Irigenin Prevents BL-Induced Cell Barrier Dysfunction in A2E-laden ARPE-19 Cells
使用TEER评估鸢尾素在BL暴露下对A2E负载的ARPE-19细胞屏障功能障碍的保护作用。暴露于BL 15分钟显著降低了TEER值，表明屏障功能受损。用鸢尾素预处理1小时以剂量依赖的方式保持了TEER值。在25和50 μM浓度下，TEER水平显著维持，证明鸢尾素有效保护了屏障完整性免受BL诱导的损伤。
3.3 Irigenin Reduces Bl-Induced Production of Proinflammatory Cytokines in A2E-laden ARPE-19 Cells
通过测量A2E负载的ARPE-19细胞中IL-1β、IL-6和TNF-α水平评估鸢尾素对BL诱导的细胞因子产生的抗炎作用。BL暴露显著增加了IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌，表明强烈的炎症反应。用25和50 μM鸢尾素预处理显著以剂量依赖的方式减少了细胞因子产生，证明鸢尾素在抑制暴露于BL的A2E负载的ARPE-19细胞中促炎细胞因子释放方面具有保护作用。
3.4 Irigenin Reduces BL-Induced Expression of Nitric Oxide Synthase and Cyclooxygenase, and Inhibits NO Production in A2E-laden ARPE-19 Cells
通过测量暴露于BL的A2E负载的ARPE-19细胞中诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、环氧化酶（COX-2）表达和NO产生水平评估鸢尾素的抗炎作用。BL暴露15分钟显著增加了iNOS、COX-2表达和NO产生。用鸢尾素预处理1小时显著以剂量依赖的方式减少了iNOS、COX-2和一氧化氮水平。在25和50 μM时，这些炎症标志物减少，表明鸢尾素减轻了BL诱导的炎症反应。
3.5 Irigenin Suppresses BL-Induced NLRP3 Inflammasome Activation in A2E-laden ARPE-19 Cells
通过分析炎症小体激活的关键标志物评估鸢尾素对BL诱导的焦亡的保护作用。在本研究中，GSDMDC1抗体靶向GSDMD内位于169至188氨基酸之间的特定内部序列，该序列位于N端结构域内。由于该表位在Gasdermin D全长（GSDMD-FL）和Gasdermin D N端片段（GSDMD-N）中都存在，因此该抗体能够识别两种蛋白质形式。具体而言，BL暴露15分钟显著增加了NLRP3、含CARD结构域的凋亡相关斑点样蛋白（ASC）、GSDMD-FL和GSDMD-N的表达以及caspase-1活性，表明NLRP3炎症小体激活和焦亡性细胞死亡。用鸢尾素预处理1小时显著以剂量依赖的方式抑制了这些标志物的上调，表明鸢尾素抑制了A2E负载的ARPE-19细胞中BL诱导的NLRP3炎症小体激活。 corroborating the above data，免疫荧光分析显示，BL暴露显著增加了细胞质和沿质膜的GSDMD和GSDMD-N表达，表明炎症小体激活和gasdermin介导的孔形成。Cy3荧光强度的定量分析证实，与对照组相比，BL暴露后GSDMD和GSDMD-N染色显著增加。相比之下，鸢尾素处理（50 μM）显著降低了总细胞和膜相关的GSDMD-N荧光强度，表明抑制了gasdermin介导的孔形成和焦亡信号。
3.6 Irigenin Attenuates BL-Induced Activation of the NFκB Pathway in A2E-laden ARPE-19 Cells
通过分别分析IκB-α和NFκB的磷酸化以及NFκB核转位评估鸢尾素对BL诱导的NFκB通路激活的影响。暴露于BL 15分钟显著增加了IκB-α和NFκB的磷酸化，反映了显著的通路激活。同时，BL暴露显著增强了NFκB核转位。用鸢尾素预处理1小时导致IκB-α和NFκB磷酸化显著、剂量依赖性的减少，在25和50 μM时观察到显著降低。类似地，鸢尾素预处理显著减少了NFκB核转位，在25和50 μM时具有显著效果，表明鸢尾素有效抑制了BL诱导的NFκB通路激活。 corroborating the above data，免疫荧光分析显示，BL暴露触发了显著的NFκB核转位，而用50 μM鸢尾素处理显著减少了A2E负载的ARPE-19细胞中的这种核积聚。并行地，使用p-NFκB特异性抗体的免疫荧光分析证明，BL暴露后核p-NFκB免疫反应性显著增加，表现为核内Cy3红色荧光增强。Cy3荧光强度的定量分析证实，与对照组相比，核NFκB和p-NFκB水平显著升高。相比之下，鸢尾素（50 μM）预处理显著减弱了BL诱导的NFκB和p-NFκB核积聚，并显著降低了核Cy3荧光强度，表明有效抑制了NFκB激活和转录信号。
3.7 Irigenin Attenuates BL-Induced Phosphorylation of p38 MAPK in A2E-laden ARPE-19 Cells
使用Western blot分析评估鸢尾素对A2E负载的ARPE-19细胞中BL诱导的p38磷酸化的抑制作用。暴露于BL 15分钟显著增加了p38磷酸化，表明p38 MAPK通路激活。用鸢尾素预处理1小时导致p38磷酸化显著、剂量依赖性的减少。值得注意的是，在25和50 μM浓度下，p38磷酸化水平显著低于BL暴露组，证明鸢尾素有效抑制了BL诱导的p38通路激活。
4 Discussion
AMD是一种受环境和分子因素影响的复杂视网膜疾病，其中炎症是核心机制。高能BL损伤视网膜细胞，增加应激并损害RPE功能。A2E是视觉周期的一种光毒性副产物，积累在RPE细胞中，是主要的脂褐素成分，也是AMD发病机制的关键贡献者。虽然本研究主要关注A2E负载条件以模拟干性AMD，但我们也进行了初步实验，仅使用BL暴露，无需A2E预处理。在相同的照射参数下（6,000 lux，15分钟），单独BL并未引起细胞损伤和氧化应激的显著变化。这可以归因于BL暴露的低强度和短暂持续时间的综合效应。这些发现进一步支持A2E在使RPE细胞对BL诱导的损伤敏感方面起关键作用。具体而言，暴露于BL导致A2E光氧化，产生反应性中间体，诱导RPE细胞死亡，引起炎症，并损害RPE屏障完整性。鸢尾素具有抗癌、抗氧化和抗炎特性，在多种疾病模型中发挥保护作用，例如阿霉素诱导的心脏毒性、通过激活BV-2细胞中的Keap1/Nrf2通路MPP+诱导的神经毒性，以及通过激活人脐静脉内皮细胞中的Nrf2通路血管紧张素II诱导的氧化损伤。本研究使用A2E负载的ARPE-19细胞作为体外模型模拟AMD条件。LDH测定结果显示细胞毒性显著增加，TEER降低，表明RPE屏障完整性受损。鸢尾素预处理以剂量依赖的方式减少了这种细胞毒性并保持了TEER，证明鸢尾素作为预防AMD中BL诱导损伤的潜在药物。因此，本研究是首批证明鸢尾素对AMD的保护作用并探索其分子机制的研究之一。
不受控制的炎症是AMD的一个关键病理特征，对其疾病进展有显著贡献。在衰老的眼睛中，RPE细胞失调促炎和抗炎细胞因子，导致持续炎症。其他研究报道了A2E负载的ARPE-19细胞中BL诱导的炎症。鸢尾素可能通过其抗炎特性减轻急性肺损伤中的弥漫性肺泡损伤和肺水肿。鸢尾素也可能抑制人脐静脉内皮细胞中血管紧张素II诱导的炎症。在本研究中，鸢尾素预处理显著减少了A2E负载的ARPE-19细胞中BL诱导的IL-1β、IL-6和TNF-α产生，突出了其调节AMD相关炎症的潜力。
NO生成与iNOS和COX-2表达密切相关，并在炎症通路中起关键作用。具体而言，上调的iNOS增加NO产生并调节免疫反应，但过量时可能引起细胞毒性；上调的iNOS也增加COX-2表达，有助于促炎介质合成并放大炎症。本研究首次提供了鸢尾素通过抑制一氧化氮、iNOS和COX-2对A2E负载的ARPE-19细胞中BL诱导的炎症具有保护作用的证据，表明鸢尾素处理减轻了BL诱导的炎症反应。
焦亡是一种由炎症信号触发的程序性细胞死亡形式，其特征是炎症小体激活、GSDMD-FL裂解和促炎细胞因子的释放。在分子水平上，焦亡执行由caspase-1依赖性切割GSDMD介导，产生插入质膜的GSDMD-N。其他研究揭示了BL暴露在A2E负载的RPE细胞中可以诱导焦亡。本研究中呈现的Western blot数据通过证明暴露于BL的A2E负载的ARPE-19细胞中NLRP3、ASC、GSDMD-FL和激活的N端片段GSDMD-N的显著上调，证实了焦亡的诱导。此外，免疫荧光测定的结果强化了这些观察结果，揭示了GSDMD-N的上调主要位于细胞质和沿质膜。Cy3荧光强度的定量分析进一步证实了BL暴露后膜相关GSDMD-N的显著增加。相比之下，鸢尾素处理导致这些信号的显著减少，包括总细胞和膜定位的GSDMD-N，从而证实了生化发现。总之，这些结果表明鸢尾素有效抑制了A2E负载的ARPE-19细胞在蓝光暴露后的炎症小体激活、gasdermin介导的膜孔形成、焦亡性细胞死亡及相关炎症反应。本研究主要关注NLRP3炎症小体；然而，新出现的证据表明其他炎症小体复合物，如AIM2，可能显著促进视网膜炎症和变性。AIM2可以识别胞质双链DNA，并已在各种视网膜损伤模型中的无菌炎症反应中 implication，特别是那些以光感受器应激和氧化DNA损伤为特征的模型。尽管当前研究未直接评估AIM2的激活，但观察到的caspase-1裂解可作为炎症小体激活的功能指标。先前的研究已确定caspase-1裂解是炎症小体激活和随后焦亡信号启动的可靠标志物，特别是当伴有GSDMD-N激活和IL-1β释放时。因此，在我们的实验模型中检测到caspase-1和GSDMD-N表明鸢尾素有效抑制了在BL和A2E条件下触发的炎症小体介导的焦亡。总之，这些发现将GSDMD-N依赖性焦亡确定为BL暴露的A2E负载ARPE-19细胞中的关键病理事件，并首次证明鸢尾素抑制了这一过程。因此，这是首项证明鸢尾素抑制BL诱导焦亡的研究，表明其保护A2E负载ARPE-19细胞损伤的潜力。
NFκB信号通路是炎症的关键介质，在包括AMD在内的各种病理条件下的焦亡和其他炎症反应中至关重要。NFκB家族由五种蛋白质组成——p50、p52、p65（RelA）、RelB和c-Rel，其中p65因其在调节促炎基因表达中的核心作用而被研究最多。当该通路暴露于炎症刺激时，p65从NFκB-IκB复合物中释放到胞质中，在特定丝氨酸残基处发生磷酸化，随后转位到细胞核，激活编码细胞因子和粘附分子等促炎介质的促炎基因。因此，NFκB p65的磷酸化依赖性激活和核转位是功能性NFκB信号传导的标志。几项研究表明，A2E负载的ARPE-19细胞中BL诱导的炎症是由NFκB信号传导介导的。当前研究表明，鸢尾素预处理通过抑制NFκB通路激活显著减轻了BL诱导的炎症反应，表现为IκBα和NFκB的磷酸化减弱，以及磷酸化NFκB的核积聚减少，从而在磷酸化和核转位水平上证实了鸢尾素对A2E负载ARPE-19细胞中BL诱导炎症的保护作用。
细胞外和细胞内刺激激活MAPK信号通路并调节关键细胞过程，如增殖、分化、存活和凋亡。该通路在炎症中的作用也将其与各种炎症性疾病联系起来。在BL诱导的RPE细胞模型中，MAPK是NFκB激活的上游介质，表明其在炎症反应中的关键作用。先前的研究表明，鸢尾素在脂多糖诱导的小鼠模型中显著抑制MAPK通路。此外，本研究证明鸢尾素预处理显著降低了A2E负载的ARPE-19细胞中BL诱导的p38 MAPK磷酸化。
虽然本研究有几个优点，但认识几个局限性仍然很重要。体外A2E负载的ARPE-19模型是模拟干性AMD特征性氧化应激和炎症条件的可行模拟。然而，它不能充分涵盖视网膜微环境的复杂复杂性。特别是，它不能捕捉RPE、Bruch膜和脉络膜血管之间的细胞和血管相互作用，也不能捕捉驱动湿性AMD进展的血管生成过程。地理萎缩可能通过VEGF依赖或非依赖机制进展为新生血管性AMD，其中VEGF是这种转变的关键介质。鉴于鸢尾素对炎症和焦亡的强效抑制，它也可能调节VEGF信号传导。然而，当前工作未解决这种可能性。因此，未来结合共培养系统验证的研究对于将这些发现扩展到血管生成并巩固机制见解是必要的。
此外，体外系统不能完全重现视网膜的免疫学和结构复杂性，其中先天免疫和细胞间相互作用关键调节疾病进展。为了解决这个问题，我们早先使用BL引起的视网膜变性小鼠模型进行的体内研究发现，鸢尾素减少了视网膜的结构损伤。它还通过刺激HO-1和NQO-1降低了氧化应激并增强了抗氧化防御，这强调了其对生理健康的重要性。除了焦亡，越来越认识到其他受调节的细胞死亡形式，如凋亡、坏死性凋亡和铁死亡，也在BL诱导的损伤下在RPE细胞中被引发。然而，需要额外的体内研究来检查炎症小体激活通路，包括NLRP3、caspase-1和GSDMD切割，并探索可能与焦亡协同作用的其他受调节细胞死亡程序，如凋亡、坏死性凋亡和铁死亡。这些努力对于全面描述鸢尾素的细胞保护机制并确立其对于干性和湿性AMD的转化潜力至关重要。
5 Conclusion
本研究进一步证明鸢尾素通过调节炎症和焦亡通路减轻BL诱导的A2E负载ARPE-19细胞损伤。具体而言，鸢尾素抑制p38 MAPK磷酸化并下调NFκB激活，减少促炎细胞因子释放并防止焦亡。这些发现表明鸢尾素通过减轻焦亡和炎症治疗AMD的潜力。
