《Journal of Neuroendocrinology》：Response of gonadotropin-releasing hormone neurons from female mice to dynamic-clamp-simulated GABAergic conductances across development and after prenatal androgenization
1 引言
女性生殖周期中，促性腺激素释放激素（GnRH）神经元的特定分泌模式对维持生育能力至关重要。周期中，从低频到高频的GnRH脉冲有助于驱动垂体前叶差异释放卵泡刺激素（FSH）和黄体生成素（LH）。FSH和LH调节卵巢卵泡成熟和类固醇生成，而类固醇反馈调节GnRH和垂体激素。这些激素模式的紊乱会损害生育能力，如多囊卵巢综合征（PCOS）中所见。高雄激素血症的PCOS患者（占女性的8%–10%）表现出持续的高频LH（推测包括GnRH）脉冲。PCOS的病因尚不清楚，但青春期前后女孩中已有PCOS样症状（如高雄激素血症和月经不调）的报道，表明生殖神经内分泌系统的紊乱在生殖成熟完成之前即可显现。
产前雄激素化（PNA）动物模型重现了PCOS的许多神经内分泌方面，并已被用于理解中枢变化。PNA小鼠表现出改变的生殖周期性、高频LH脉冲和升高的血清睾酮浓度。PNA处理改变了GnRH神经元的生理特性。例如，在载体（VEH）处理的雌性中，GnRH神经元的自发放电率在3周龄时达到峰值，随后在成年期降至较低水平。相反，PNA雌性中GnRH神经元的自发放电率在整个发育过程中不发生变化；因此，PNA雌性的GnRH神经元放电率在3周龄时低于对照组，但在成年期更高。PNA处理还增加了所有研究年龄阶段向GnRH神经元的GABA能神经传递频率。成年GnRH神经元维持高细胞内氯离子浓度，GABAA受体的激活使这些细胞去极化并可导致动作电位放电。与3周龄VEH雌性相比，3周龄PNA雌性GnRH神经元的自发放电率较低，起初令人惊讶，因为PNA雌性接受更高频率的GABA能神经传递，但尽管基线电位或氯反转电位无差异，3周龄PNA雌性对局部施加GABA的放电反应减弱。这表明其他GnRH神经元内在特性的变化，如电压门控通道、输入电阻和电容，导致了该年龄阶段PNA雌性对GABA反应的减弱。来自成年雌性的GnRH神经元比来自3周龄雌性的更具兴奋性，后超极化电位（AHP）的最大幅度更大且延迟。PNA对这些参数没有影响。一个瞬时和一个残余钾电流的特性随年龄和/或PNA处理而改变。初步报告表明，PNA处理在两个年龄阶段均增加了钙电流密度。
使用传统的膜片钳方法研究GnRH神经元内在特性如何改变其对生理突触输入的响应是不可能的。这是因为用于优化研究特定离子电导的条件通常排除了检查其他电导或动作电位的可能性。本研究使用动态钳制（一种混合计算/电生理技术）来测试来自3周龄和成年VEH及PNA雌性小鼠的GnRH神经元内在特性是否改变了其对模拟GABA能电导的响应。这种二乘二设计使我们能够探究年龄和处理相关GnRH神经元动作电位输出变化背后的机制。
2 材料与方法
2.1 动物
GnRH-GFP (Tg(Gnrh1-EGFP)51 Sumo MGI:6158457) 小鼠在本实验室繁殖。所有小鼠自由摄食饮水；非繁殖鼠饲喂Envigo 2916，繁殖鼠饲喂Envigo 2919 (Envigo Bioproducts Inc., Madison, WI, USA)。小鼠饲养在14:10光暗循环下，灯光在东部标准时间凌晨3点开启。为生成PNA小鼠，将具有C57Bl/6J背景的雌性GnRH-GFP转基因小鼠和一只CD1雌鼠与一只C57Bl/6J雄鼠同笼。CD1母鼠协助提供母体照顾和营养。每天监测雌鼠的阴道栓（妊娠第1天）。在妊娠第16-18天，给GnRH-GFP母鼠皮下注射225 μg/天的二氢睾酮（DHT，溶于50 μL芝麻油）进行PNA处理，或注射芝麻油作为VEH处理的对照。出生后1周，通过淘汰CD1幼崽（通过体型和毛色识别）将窝产仔数调整至<15只以标准化营养。所有程序均经密歇根大学机构动物护理和使用委员会批准。
2.2 PNA表型验证
电生理研究使用来自3周龄（18–21天）青春期前或成年（96–169天）动情间期雌性的脑切片进行，动情周期阶段通过阴道细胞学确定并经子宫质量确认。PNA表型在成年研究的动物中直接检查；对于青春期前小鼠，PNA表型在饲养至成年的同窝仔中检查，因为其在同窝仔中是一致的。通过监测阴道开口（VO）年龄、成年期连续14天通过阴道灌洗进行的动情周期性以及70–72日龄时的肛门生殖器距离（AGD）（连续三天每日测量的平均值）来测量PNA效应。
2.3 脑切片制备
所有溶液在使用前用95% O2/5% CO2鼓泡至少15分钟。脑切片在光照开始后3.5–6.5小时制备。将小鼠断头，取出大脑并置于冰镇蔗糖盐水中（成分，单位mM）：250蔗糖，3.5 KCl，26 NaHCO3，10 D-葡萄糖，1.25 Na2HPO4，1.2 MgSO4和2.5 MgCl2（350 mOsm）。使用Leica VT1200S切片机（Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL, USA）切割穿过下丘脑区域的冠状切片（300 μm）。将切片在室温（~21°C–23°C）下于50%蔗糖盐水/50%人工脑脊液（ACSF，成分[单位mM]：135 NaCl，3.5 KCl，26 NaHCO3，10 D-葡萄糖，1.25 Na2HPO4，1.2 MgSO4，2.5 CaCl2，315 mOsm，pH 7.4）中孵育30分钟。然后将切片转移至100% ACSF中，在室温下至少放置30分钟，然后用于记录。所有记录在脑切片制备后1-6小时内进行；记录之间没有因脑切片制备后的时间而导致的差异。每组研究至少来自5窝的5只小鼠；每只小鼠最多使用3次记录。
2.4 记录溶液和数据采集
使用全细胞电压钳记录测量GnRH神经元中的GABA能突触后电流（PSCs）；ACSF中含有20 μM D-APV (Tocris)和10 μM CNQX (Tocris)分别阻断离子型NMDA和AMPA受体。使用全细胞电流钳记录测量GnRH神经元对模拟电导的响应；ACSF中含有20 μM D-APV、10 μM CNQX和100 μM印防己毒素以阻断离子型谷氨酸和GABA能受体。记录电极（2–4 MΩ）由硼硅玻璃使用Sutter P97拉制仪（Sutter Instruments）制备，并填充含有（单位mM）的溶液：120 K-葡萄糖酸盐，20 KCl，10 HEPES，5 EGTA，0.1 CaCl2，4 MgATP和0.4 NaGTP，305 mOsm，用NaOH调至pH 7.2。该溶液基于使用革兰氏霉素穿孔膜片记录确定的GnRH神经元中的天然细胞内氯离子浓度。在每个记录之前在线抵消14.5 mV的液接电位。在所有记录过程中，使用内置加热单元（Warner Instruments Model SH-27B）以3 mL/min的速度连续灌注鼓泡的ACSF，并将温度维持在30°C–31°C。通过红外微分干涉对比和荧光显微镜在Olympus BX50WI或BX51WI显微镜上可视化GFP标识的GnRH神经元。使用EPC-10膜片钳放大器和运行PatchMaster软件（HEKA Elektronik）的计算机进行记录。记录以20 kHz采集并以10 kHz滤波。在整个实验过程中，通过平均膜电流对16个超极化电压阶跃（从-70 mV用于GABA PSC记录，-65 mV用于动态钳记录，5 mV，20 ms）的响应来监测记录质量和被动特性。所有电流钳记录均使用桥平衡（90%）。使用WaveMetrics IgorPro（Sutter Instruments）分析数据。仅使用输入电阻在410和1500 MΩ之间、稳定的补偿后串联电阻为7.9–30 MΩ且电容稳定（5.7pF–30 pF）的记录进行分析。
2.5 GnRH神经元中分离的GABA能PSCs的特性
GABA能PSCs的衰减时间常数强烈依赖于记录电极中的氯离子浓度。因此，我们使用生理氯离子浓度（上述K-葡萄糖酸盐溶液）在保持在-70 mV的细胞中测量了GnRH神经元上GABA PSCs的特性。为每个记录的细胞（每个细胞5到40个分离事件）平均分离的GABA能PSCs（定义为相邻事件峰值之间至少间隔50 ms的事件）。测量平均PSC的幅度和衰减时间常数。衰减时间常数（tau）使用单指数拟合从每个细胞的标准化、平均PSC峰值的80%到20%进行估计，仅允许tau变化。
2.6 GABA能突触后电导的建模
在使用生理Cl?浓度记录的组间未检测到平均GABA PSCs幅度的差异。因此，使用了在GABA PSCs生理范围内及适度高于该范围的一系列电导（1, 2, 5, 10 nS）。相反，检测到衰减时间常数存在年龄依赖性增加，从7.4 ± 0.1 ms增加到9.9 ± 0.2 ms（双向方差分析，F(1,19) = 7.76, p = 0.011）。因此，每个电导建模两次：使用代表3周龄雌性的7 ms单指数衰减时间常数，和代表成年雌性的10 ms衰减时间常数。
2.7 动态钳记录
使用Cybercyte V10 (CytoCybernetics, Inc.)进行动态钳记录。动态钳系统的输入是电流钳模式下从EPC10膜片钳放大器读取的细胞膜电位（Vm）；动态钳系统的输出是计算出的命令电流Icmd，它驱动EPC10放大器的电流命令输入。系统测量的平均环路时间为21.29 ± 0.03 μs（平均值±标准误）。为了在动态钳模式下实现突触电导模型，Icmd根据突触后电导（gsyn）作为触发后时间的函数以及线性驱动力计算得出。在下面的等式中，Erev是GABA的估计反转电位（Erev= -36.5 mV），gsyn是单指数衰减。
每个记录的保持电流被调整以将膜电位维持在-63.5和-66.5 mV之间。进行了初步研究以确定膜响应恢复所需的记录扫描持续时间以及刺激顺序是否影响响应。初始记录扫描为5.5秒，模拟电导在0.5秒时触发。这些初始记录显示，GnRH神经元的响应在测试电导开始后1秒内已恢复到基线，因此模拟电导开始后的持续时间减少到3秒。此外，使用此间隔，随机化模拟GABA能电导的顺序不会改变GnRH神经元的响应。对于每个细胞，以升序或降序施加每种电导的一系列10次应用，针对每个时间常数。
2.8 数据分析
模拟的GABA能电导引发两种类型的响应：阈下动态钳诱导的突触后电位（dcPSP）或在此期间发生动作电位（AP）的dcPSP；后一类根据时间进一步细分。为了分析没有AP污染的dcPSP，对在模拟电导开始前10 ms内基线稳定在要求范围（-63.5至-66.6 mV）内的至少五个迹线进行平均。分析平均迹线的以下参数。延迟计算为从模拟GABA电导开始到dcPSP峰值的时间。幅度是刺激前基线与dcPSP峰值之间的差值。衰减时间是从dcPSP的80%到20%的时间（ms）。
为了单独检查电容对dcPSP形状的影响，使用了计算机模拟RC电路。电阻设置为所有记录细胞的平均输入电阻（737 ± 24 MΩ, 74个细胞），电容以2 pF为增量从8 pF变化到16 pF，这涵盖了动态钳记录中测试的模拟GABA能电导所测量值的85%以上。电压在一个时间步长Δt的变化由给定方程描述。Isyn基于方程，Ileak= gleak(V ? Eleak)。gleak是平均输入电阻的倒数，Eleak设置为-65 mV。Δt设置为0.1 ms。
在动态钳记录中，一些GnRH神经元对模拟的GABA电导响应产生单个动作电位；这些大多数出现在dcPSP的上升相，但有一个子集出现在dcPSP的衰减相。分析了这些动作电位的特性。具体来说，动作电位阈值定义为膜电位二阶导数斜率超过10,000 V/s/s的时间和电位。动作电位延迟是从模拟GABA电导开始到阈值的时间。幅度计算为从阈值到动作电位峰值的膜电位变化。上升速率是从阈值到动作电位峰值的最大电压导数。半高全宽（FWHM）在阈值和峰值之间的中点计算。后超极化电位（AHP）时间和幅度相对于阈值测量。
2.9 统计学
使用Shapiro–Wilk检验测试数据的正态分布。数据根据情况报告为平均值±SEM或中位数±四分位距（IQR），并在可行时显示个体值。根据实验设计和数据分布选择统计检验。关于统计检验和数据分布的信息在结果部分和表格中指定。使用Prism 10.1.1 (GraphPad Software)进行统计比较，但用于分析在每个动情周期阶段所花费时间比例的统计分析除外，为此使用了R，因为Prism无法运行适当的卡方检验。使用R (R version 4.3.1 “Beagle Scouts”)在RStudio中进行分析，并结合使用开源包，包括rstatix和flextable，其中使用了“chisq_test”、“chisq_descriptives”、“row_wise_fishers_test”和“p.adjust.method”函数来运行卡方检验。由于细胞数量少，未对测量的动作电位特性进行统计分析。显著性设定为p < 0.05。
3 结果
3.1 PNA表型的验证
本研究证实了已报道的PNA诱导的表型差异。PNA雌性的阴道开口（VO）年龄早于VEH雌性（Mann–Whitney U检验, U 57.5, p < 0.0001）。PNA雌性在VO时的体重低于VEH雌性（Mann–Whitney U检验, p < 0.0001），成年PNA雌性的肛门生殖器距离（AGD）长于VEH雌性（Mann–Whitney U检验, p < 0.0001）。成年PNA雌性的动情周期被打乱。具体来说，与VEH雌性相比，PNA雌性在动情间期度过的时间更多（p < 0.0001），在动情期（p < 0.0002）和前情期（p < 0.0001）度过的时间更少（χ2检验）。
3.2 GnRH神经元中GABA能PSCs的衰减时间常数随年龄增加但不受PNA处理影响
使用全细胞电压钳记录测量来自3周龄和成年VEH及PNA雌性小鼠的GnRH神经元中分离的GABA能突触后电流（PSCs）的特性，使用生理细胞内氯离子浓度（3周VEH n=5个细胞，3周PNA n=6个细胞，成年VEH n=6个细胞，成年PNA n=5个细胞）。图2A显示来自每组的标准化迹线示例。发育和PNA处理均未改变GABA能PSCs的幅度（图2B，双向方差分析，表2）。然而，GABA能PSCs的衰减动力学存在发育变化（图2C）。具体来说，来自3周龄VEH（n=5个细胞）和PNA雌性（n=6个细胞；7.4 ± 0.13 ms）的细胞的衰减时间常数比来自成年VEH（n=6个细胞）和PNA雌性（n=6个细胞；9.9 ± 0.25 ms）的细胞更快（p = 0.0007）。基于这些发现，使用了四种不同的测试电导（1, 2, 5 和 10 nS），反转电位为-36.5 mV。每个GABA电导模拟两次：使用代表3周龄雌性的7 ms单指数衰减时间常数，和代表成年雌性的10 ms衰减时间常数，总共八种不同的动态钳条件。图2D显示了成年VEH组模拟GABA电导和 resulting dcPSPs的代表性示例。
3.3 动态钳诱导的突触后电位（dcPSPs）的动力学特性在很大程度上与被动膜特性的变化一致
动态钳研究中，各组GnRH神经元的输入电阻（图3A）或串联电阻（图3B）没有差异。然而，电容存在年龄依赖性增加（图3C）。维持成年GnRH神经元在-63.5 mV和-66.5 mV之间所需的超极化电流少于3周龄小鼠的神经元（双向方差分析，图3D；表3）。在施加模拟GABA电导时，基线膜电位没有差异，除了1 nS/7 ms衰减时间电导组存在年龄和处理的轻微交互作用（表4）；这并未导致下面dcPSP特性的组间差异。
模拟的GABA能电导（1, 2, 5 或 10 nS）具有7或10 ms的衰减时间常数，被施加到四组GnRH神经元。表5显示了每组包含的细胞总数。对于中等幅度电导（2和5 nS）且衰减时间常数为7 ms的情况，观察到峰值延迟（图4，表6）存在轻微的发育诱导增加；对于5 nS/10 ms电导也观察到这些变化。这些发育转变可能归因于电容的发育性增加。在成年小鼠中观察到80/20衰减时间增加的类似模式，但增加了年龄与PNA处理的交互作用以及处理效应在来自成年PNA小鼠的细胞中增加了衰减时间（图5，表7）。PNA处理的影响表明，由dcPSP去极化激活的电压门控通道群体发生了变化，成年PNA小鼠中的通道作用延长了去极化。
dcPSPs的幅度在最小的测试电导（对于两种衰减时间常数）下，成年小鼠中轻度较低，再次与电容的发育增加一致（图6，表8）。比较中间电导2或5 nS的dcPSP幅度 among groups 更为细微。具体来说，虽然动力学特性的大多数变化主要与发育相关并与电容变化一致，但dcPSP幅度更受处理和处理与发育交互作用的影响。值得注意的是，来自3周龄VEH小鼠的细胞比来自3周龄PNA小鼠或成年VEH小鼠的细胞具有更高的dcPSP幅度。在最高幅度电导下，未观察到dcPSP幅度的差异。
3.4 电容影响的计算机模拟分析
几个量化的dcPSP特性具有明显的年龄依赖性效应（3周与成年）。由于成年细胞的电容高于3周龄记录的细胞，我们进行了简单的电阻电容（RC）电路模型，以了解变化电容如何影响dcPSP的形状。输入电阻设置为所有记录细胞的平均输入电阻（737 ± 24 MΩ, 74个细胞），电容以2 pF为增量从8 pF变化到16 pF（图7）。该分析表明，所报告的dcPSP参数的年龄效应可能归因于与年龄相关的电容增加。
3.5 GnRH神经元对5 nS模拟GABA电导的动作电位响应
在任何组中，没有细胞对1或2 nS模拟电导产生放电。15个来自3周龄VEH雌性的神经元中有5个对5 nS、7 ms衰减时间常数电导产生放电；在10次测试的迹线中，有2-10次观察到这种响应，并且迹线顺序没有影响。其他实验组的细胞没有对该电导产生动作电位。当5 nS电导的衰减时间常数增加到10 ms时，15个来自3周龄VEH雌性的细胞中有6个产生了动作电位。相反，13个来自VEH成年的细胞中只有1个，10个来自PNA成年雌性的细胞中有2个产生了动作电位。13个来自3周龄PNA雌性的细胞中没有一个对5 nS电导产生动作电位。由于只有来自3周龄VEH雌性的细胞有足够的数据进行甚至初步的统计分析，我们比较了两种不同衰减时间常数产生的动作电位的特性。未发现任何检查的特性存在差异（所有p < 0.13，经Welch校正的非配对t检验；表9）。
3.6 GnRH神经元对10 nS模拟GABA电导的动作电位响应
图8A和9A分别显示了7 ms和10 ms衰减时间常数的动作电位代表迹线。由于只有一到两个来自成年VEH小鼠的细胞放电，未进行统计比较，但数据在图8B–H和9B–H以及表5、10和11中显示。定性观察包括，无论衰减时间常数如何，对测试的10 nS模拟GABA电导产生动作电位的细胞比例（29.9%；107个细胞中的32个）高于5 nS电导（13.6%，103个细胞中的14个）。来自成年VEH对照小鼠的细胞最不可能放电（11.5%），而来自3周龄VEH小鼠的细胞最可能放电（41.4%）。
在3周龄PNA雌性的一个记录子集中检测到延迟的动作电位（“延迟峰”）。图10显示了10 ms衰减时间常数的电导数据。只有一個細胞使用7 ms衰減時間常數表現出延遲峰，而兩個細胞使用10 ms衰減時間常數響應產生延遲峰（其中一個也產生了典型的動作電位）。延遲峰發生在dcPSP峰值之後。這是僅在3周齡PNA組中觀察到的現象，這使其很有趣，但考慮到沒有正式的設計，統計分析可能不合適，數據僅供參考。這些峰具有明顯更長的潛伏期、超極化的閾值、較低的上升速率、較低的幅度、較大的FWHM、較小的AHP以及達到AHP峰值的時間比非延遲峰更長（圖10B–H，表11）。閾值電位（定義為二階導數 >10,000 V/s/s）相對於非延遲峰似乎超極化，並且在每種情況下都相對於dcPSP的峰值超極化。
4 讨论
女性生殖周期中GnRH/LH的动态分泌模式对维持生殖至关重要。这些分泌模式的破坏，如在高雄激素血症PCOS患者中观察到的那样，会导致生育能力受损。本研究使用动态钳技术模拟相同的生理性GABA能电导，作用于来自3周龄和成年VEH及PNA雌性的GnRH神经元，以测量GnRH神经元内在特性的差异如何塑造其对突触输入的响应。
在分析的dcPSP特性中，幅度表现出最显著的PNA处理差异。这在两种衰减时间常数的中间测试电导中观察到。测试的两种衰减时间常数反映了该参数的发育差异，但幅度响应模式相同。具体而言，在2和5 nS电导下，来自3周龄VEH小鼠的细胞比来自3周龄PNA和成年VEH小鼠的细胞具有更大的dcPSPs。3周龄PNA与VEH小鼠相比dcPSP幅度降低可能归因于阈下电压门控钾通道的更大激活，抵消了进一步的膜去极化。瞬时钾电流密度在3周龄PNA小鼠中大于3周龄VEH小鼠。与此一致，3周龄PNA雌性对局部GABA应用的动作电位反应弱于3周龄VEH雌性。在VEH小鼠中观察到dcPSP幅度存在发育性降低。由于存在动作电位时检测dcPSP峰值的复杂性，具有动作电位的dcPSPs未包括在此比较中，可能排除了此比较中较大幅度的dcPSPs。然而，在动作电位启动最频繁的组（3周龄VEH）中观察到最大的dcPSP幅度；这表明dcPSP幅度的发育性降低是由其他因素驱动的。一种可能性是成年VEH小鼠中瞬时阈下钾电流激活的电压依赖性超极化，这可能抵消膜去极化。
有趣的是，在测试的最大电导下，组间幅度没有差异。虽然这部分可能归因于启动动作电位的dcPSPs数量增加而被排除，从而降低了统计效能，但该电导产生的较大去极化可能克服了在更轻微去极化下观察到的组间电流差异激活。尽管使用生理氯离子水平的记录对突触电导进行建模，我们的测试电导如何与体内GABA能输入至GnRH神经元的特性相比较仍然未知。然而，观察到的dcPSP幅度变化表明，VEH小鼠的GnRH神经元在青春期前更容易对突触输入产生响应。确实，测试的最高电导在青春期前对照组中产生了更多的动作电位。需要指出的是，使用动态钳模拟电导排除了递质释放或突触后受体组成的变化作为dcPSP特性任何变化的贡献者。总之，这些观察表明年龄和PNA处理都可以改变GnRH神经元的输出（定义为动作电位放电）。这些观察结果与先前数据一致，即3周龄VEH雌性的GnRH神经元在这些组中具有最高的自发放电活动。
本研究中年GnRH神经元降低的动作电位反应与使用相同动物模型但不同电生理方法的先前研究形成对比。使用传统的去极化电流钳阶跃（0.5秒持续时间）检查兴奋性，成年雌性的GnRH神经元比3周龄雌性的神经元更具兴奋性（定义为在给定电流注入阶跃下的动作电位数量），无论PNA处理如何。对此至少有三种可能的解释。首先，动态钳模拟单个突触电导，提供了更生理的刺激；也就是说，动态钳注入的电流随着目标细胞去极化而修改，而电流在阶跃刺激期间是恒定的。有趣
