《Neuroscience Letters》：Chronic alcohol consumption and abstinence disrupt cholinergic gene expression in the mesopontine tegmentum of alcohol-preferring iP rats
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酒精依赖动物模型中，PPTg和LDTg通过双向投射直接调控基底节区胆碱能信号，长期酒精摄入和戒断导致PPTg Chrm4和LDTg Chrna7表达显著变化，揭示了酒精依赖的神经生物学机制。
作者：Shivani P. Vaidya、Daisy L. Spark、Leigh C. Walker、Paulo Pinares-Garcia、Roberta G. Anversa、Andrew J. Lawrence
机构：澳大利亚墨尔本大学弗洛里神经科学与心理健康研究所（The Florey Institute of Neuroscience and Mental Health, University of Melbourne, Parkville, Australia）
摘要
中脑被盖（mesopontine tegmentum，MPT）由脚桥被盖（pedunculopontine tegmentum，PPTg）和外侧背侧被盖（laterodorsal tegmentum，LDTg）组成，通过直接投射到关键区域（如纹状体、黑质和腹侧被盖区）来调节奖赏和厌恶反应。长期饮酒后戒酒会显著降低背外侧纹状体中的M4胆碱能受体表达。由于中脑被盖（MPT）向该区域发出的胆碱能神经冲动是乙酰胆碱的外部来源，因此研究酒精暴露及随后的戒酒如何影响MPT中的胆碱能系统至关重要。在本研究中，我们首先描述了酒精偏好型iP大鼠（induced pluripotent rats）中PPTg和LDTg向背侧纹状体的投射情况，随后评估了长期自愿饮酒和戒酒后MPT中胆碱能基因表达的变化。通过结合逆行追踪和免疫荧光技术，我们发现PPTg和LDTg向背外侧和背内侧纹状体提供直接的胆碱能神经支配，但其定位特异性低于其他品系的研究结果。在连续六个月的可间歇性饮酒期间，LDTg中的Chrna7基因表达暂时下降，但在戒酒14天后恢复到基线水平；同时PPTg中的Chrm4基因表达降低。这些发现表明，长期自愿饮酒会重塑中脑的胆碱能信号通路，这可能为酒精使用障碍（alcohol use disorder，AUD）的神经生物学机制提供依据。
意义声明
长期自愿饮酒会重塑中脑的胆碱能信号通路，这可能为酒精使用障碍的神经生物学机制提供解释。
引言
中脑被盖（MPT）包括脚桥被盖（PPTg）和外侧背侧被盖（LDTg），这一脑干结构逐渐被认为是奖赏和厌恶反应的关键调节器[1][2][3]。MPT神经元直接支配纹状体、黑质（SN）和腹侧被盖区（VTA），在编码目标导向行为、药物相关奖赏强化以及条件性位置偏好方面发挥关键作用[4][5][7]。在酒精使用障碍（AUD）的背景下，MPT向背侧纹状体的胆碱能投射尤其值得关注：在人类和大鼠中，长期饮酒后M4胆碱能受体在特定亚区表现出基因和蛋白质水平的下调[8]。
先前的研究已确定了Long Evans大鼠中PPTg和LDTg向背侧纹状体的胆碱能投射在空间分布和功能上的差异[4][9]。尽管这两种神经元群体都支配纹状体的胆碱能中间神经元和中棘神经元，但PPTg神经元主要投射到背外侧纹状体（DLS），而LDTg神经元则更倾向于投射到背内侧纹状体（DMS）和伏隔核（NAc）[9]。MPT向纹状体的投射组织及其功能效应与DMS和DLS在塑造行为-结果关联中的作用一致[10]。抑制LDTg向DMS的胆碱能传递会损害目标导向行为，而抑制PPTg向DLS的胆碱能传递则会损害习惯性行为[4]。这些结果表明，随着长期饮酒使初始的目标导向饮酒行为演变为习惯性行为，PPTg和LDTg向背侧纹状体的胆碱能信号通路可能在此过程中发挥作用[11]。
多项证据表明MPT的胆碱能信号通路在调节酒精效应中起重要作用：成年Wistar大鼠长期饮酒后，PPTg和LDTg中的胆碱能神经元会增生，但总体ChAT阳性神经元数量未发生变化[12]；相反，在青少年时期大量饮酒后，Wistar大鼠MPT中的ChAT阳性神经元数量显著减少[12][13]。在PPTg中，注射卡巴胆碱（同时作用于胆碱能和尼古丁能乙酰胆碱受体的激动剂）或东莨菪碱（非选择性胆碱能受体拮抗剂）可减少酒精偏好型大鼠的饮酒行为[14]；而急性或慢性乙醇处理可增强小鼠PPTg胆碱能神经元的活性，但不会影响LDTg[15]。在LDTg中，酒精处理可通过增强PKA依赖性的脱敏作用抑制α7 nAChRs，从而导致Sprague Dawley大鼠脑切片中的运动功能障碍[16]。然而，这些研究均未探讨酒精对MPT内特定乙酰胆碱受体亚型的影响。
在本研究中，我们描述了酒精偏好型iP大鼠中PPTg和LDTg向背侧纹状体的投射情况。临床前研究表明，这些MPT胆碱能神经通路上的乙酰胆碱受体可调节纹状体中的乙酰胆碱释放[17]。随后我们评估了长期自愿饮酒和戒酒后PPTg和LDTg中胆碱能基因表达的变化。这项研究首次证实了PPTg和LDTg向背侧纹状体的双侧投射，并揭示了长期饮酒和戒酒后两者胆碱能基因表达的差异。
动物
我们从弗洛里研究所的繁殖群体中获得了350–400克的成年酒精偏好型iP大鼠（induced pluripotent rats），年龄约为7周。这些大鼠的亲本系此前由T. K. Li在印第安纳大学获得。大鼠被饲养在温度可控的环境中，每笼2只，遵循正常的12小时光照/黑暗周期（早上7点开灯），并提供筑巢材料和食物（实验室饲料，Barastoc，Rat and Mouse，Ridley AgriProducts，产品代码102093）。
PPTg和LDTg向背侧纹状体提供直接的双侧胆碱能输入
传统上认为纹状体中的乙酰胆碱仅来源于胆碱能中间神经元；然而，最近的研究表明Long Evans大鼠的MPT也能直接向背侧纹状体提供胆碱能输入[9]。鉴于不同品系在纹状体和MPT中的胆碱能受体密度存在差异[23]，我们首先使用逆行追踪技术研究了酒精偏好型iP大鼠中PPTg和LDTg向DLS和DMS的投射情况。
讨论
基于最近的研究结果表明MPT是奖赏和厌恶反应的关键调节器[1][2][3]，本研究探讨了酒精偏好型大鼠中MPT向背侧纹状体的胆碱能和非胆碱能神经支配，并评估了长期自愿饮酒及戒酒后PPTg和LDTg中的胆碱能基因调控情况。通过结合逆行追踪和免疫荧光技术，我们发现MPT中的胆碱能神经元向背侧纹状体提供胆碱能输入。
作者贡献声明
- **Shivani P. Vaidya**：撰写、审稿与编辑、数据分析。
- **Daisy L. Spark**：撰写初稿、数据分析。
- **Leigh C. Walker**：撰写、审稿与编辑、监督、方法学设计、数据分析、概念构建。
- **Paulo Pinares-Garcia**：数据分析。
- **Roberta G. Anversa**：撰写、审稿与编辑、监督。
- **Andrew J. Lawrence**：撰写初稿、监督、项目管理、资金获取、概念构建。
致谢
AJL获得了NHMRC协同基金（2009851）的支持；LCW获得了NHMRC新兴领导者奖学金（2008344）的支持；SV获得了墨尔本大学的科研奖学金。为实现开放获取，作者已将本研究的任何已接受的手稿版本授权使用CC BY公共版权许可。我们感谢维多利亚州政府在基础设施方面的支持，以及弗洛里显微镜设施的协助。
