《Postharvest Biology and Technology》：SlCNR promotes the lycopene accumulation and reduces abscisic acid content in postharvest tomato fruit
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番茄SlCNR转录因子调控后收获成熟中番茄红素环化与ABA代谢的分子机制研究。使用CRISPR/Cas9创制SlCNR敲除和过表达植株，发现KO SlCNR番茄红素含量降低50-70%，ABA水平升高，乙烯合成减少且外源乙烯无法逆转番茄红素积累。分子机制表明SlCNR直接抑制LCY-E和LCY-B基因，激活CYP707A2基因，从而调控番茄红素合成与ABA代谢平衡，延缓成熟进程。
张帅|孟明哲|陈迪|马立群|张世元|胡婷婷|于琳|曹建康|傅大琦|朱本忠|朱洪亮|曲贵勤
中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京100083
摘要
番茄红素环化和脱落酸（ABA）的代谢对果实采后成熟和颜色发展起着重要作用；然而，这些过程受果实相关转录因子（TFs）的转录调控机制尚不明确。本研究利用CRISPR/Cas9技术构建了敲除和过表达番茄品系，以探究Colorless non-ripening（SlCNR）基因在果实采后成熟中的作用。SlCNR属于SBP/SPL家族转录因子，在番茄果实中高表达。果实成熟时呈绿色，然后在室温下储存16天，期间每隔4天监测一次与成熟相关的品质指标，包括硬度、总可溶性固形物、番茄红素含量、总黄酮含量和重量损失。与野生型（WT）果实相比，敲除SlCNR的果实b*值增加，番茄红素含量减少50–70%，ABA水平升高；而过表达SlCNR的果实则表现出相反的趋势。敲除SlCNR的果实采后产生的乙烯较少，外源乙烯处理也无法使番茄红素含量恢复到野生型水平。转录组学和qRT-PCR分析显示，SlCNR转基因果实中的番茄红素环化基因和ABA代谢基因发生了显著的变化。此外，电泳迁移率和双荧光素酶报告基因实验表明，SlCNR直接抑制番茄红素环化基因SlLCY-E和SlCYC-B以及ABA合成基因SlNCED1的表达，同时激活ABA降解基因SlCYP707A2的表达，从而促进番茄红素的积累并减少ABA的合成。综上所述，SlCNR是一个在果实采后成熟过程中整合番茄红素环化和ABA代谢的转录调节因子。
引言
采后成熟技术被广泛用于延长 climacteric 果实的保质期并便于储存和运输；因此，这些果实通常在成熟绿色期或 pre-climacteric 期收获，并在常温或受控条件下进行后熟（Al-Dairi 等，2023；Joas 等，2012；Maduwanthi 和 Marapana，2019；Zhang 等，2020）。然而，与在植株上成熟的果实相比，采后成熟会改变与成熟相关的代谢过程，导致质量相关代谢物（尤其是番茄红素等色素）的积累不足（Arah 等，2015；Min 等，2022；Wang 等，2023a）。番茄果实是研究采后成熟的模式生物，已通过大规模转录组学、代谢组学和表观基因组学方法鉴定出与成熟过程和颜色发展相关的基因和途径（Bai 等，2023；Giovannoni，2004；Zhou 等，2024a）。尽管这些研究提供了有价值的信息，但大多数研究依赖于未经过基因改造的果实或外源化学处理，限制了候选调控因子的功能验证。特别是，果实特异性转录因子在采后成熟过程中的转录功能仍不明确。因此，需要利用稳定的转基因果实进行功能分析，以阐明果实采后颜色发展和品质维持的调控机制。
番茄红素是番茄中的主要抗氧化类胡萝卜素，它是一种由异戊二烯前体在质体中合成的非环状化合物，赋予成熟番茄红色，并具有强效的抗氧化活性（Ballester 等，2010；Caseiro 等，2020）。番茄红素的生物合成始于phytoene synthase（PSY）催化geranylgeranyl pyrophosphate（GGPP）缩合生成phytoene。随后通过phytoene desaturase（PDS）和ζ-carotene desaturase（ZDS）进行去饱和反应，再通过15-cis ζ-carotene isomerase（ZISO）和carotenoid isomerase（CrtISO）进行异构化，最终生成all-trans番茄红素（Liu 等，2015）。关键番茄红素合成基因SlPSY1、SlPDS和SlZDS的表达与番茄红素含量呈正相关（Fantini 等，2013）。番茄和柑橘中的PSY1和PDS基因受到SIBBX20、SIHY5、SlRIN和CsMADS3等多种转录因子的调控（Li 等，2018；Wang 等，2021；Xiong 等，2019；Zhu 等，2023）。
植物中番茄红素的积累反映了其从头合成与环化之间的精细平衡。番茄红素的环化通过两条途径实现：一条由番茄红素β-环化酶（LCY-B）催化生成β-胡萝卜素，另一条由番茄红素ε-环化酶（LCY-E）催化生成α-胡萝卜素（Liu 等，2015）。LCY-B和LCY-E基因在柑橘、木瓜和番茄物种中均有表达，并与番茄红素含量呈负相关（Alquézar 等，2009；Devitt 等，2010；Wu 等，2022）。质体特异性的番茄红素β-环化基因SlCYC-B在番茄果实中表达（Ronen 等，2000）。与野生型相比，敲除SlCYC-B可增加番茄果实成熟初期和红色阶段的番茄红素积累（Arruabarrena 等，2023），而过表达SlLCY-E可增加α-胡萝卜素和叶黄素的合成，同时降低番茄红素含量（Wu 等，2022）。
此外，环化的类胡萝卜素中间体（如β-胡萝卜素）是脱落酸（ABA）合成的前体，9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase（NCED）和ABA aldehyde oxidase（AO）是驱动ABA形成的关键酶，而ABA的降解主要由ABA 8’-hydroxylase（CYP707A）调节（Liu 等，2015；Wu 等，2023）。直接调控ABA合成酶可以调节ABA的积累，并对上游的番茄红素代谢产生反馈控制。在番茄中抑制SlNCED1的表达可降低果实ABA含量并同时增加番茄红素积累（Sun 等，2012）。然而，果实中与成熟相关的转录因子在番茄红素环化和ABA代谢途径中的直接调控作用尚未完全阐明。
SBP/SPL转录因子家族成员在多种物种中被广泛记录，可调节多种生物过程，包括果实发育或成熟、应激反应以及开花时间的协调（Jung 等，2016；Ma 等，2021；Sun 等，2023）。SlCNR是SBP/SPL转录因子家族的成员，在番茄果实中高表达（Manning 等，2006）。CRISPR/Cas9技术敲除SlCNR显著增强了番茄果实成熟过程中的黄酮积累并减少了水分损失（Chen 等，2024；Zhou 等，2024b）。然而，SlCNR在果实采后品质（尤其是调控番茄红素积累）中的调控作用仍需进一步研究。通过使用CRISPR/Cas9编辑和过表达番茄品系，我们发现SlCNR通过直接调控类胡萝卜素环化和ABA代谢相关基因来调节番茄红素和ABA的积累。此外，抑制SlCNR的表达可延长番茄的保质期并维持可溶性糖的水平。这些发现扩展了SlCNR在果实采后成熟中的功能作用，并加深了我们对SBP/SPL转录因子在调节果实品质方面的理解。
植物材料
所用植物材料基于野生型番茄（Solanum lycopersicum cv. Ailsa Craig）的遗传背景。SlCNR敲除和过表达品系由我们实验室制备（Chen 等，2024；Gao 等，2019）。详细信息见补充方法部分。在之前的研究中，我们使用特异性抗SlCNR多克隆抗体进行了Western blot分析，证实敲除品系中不存在SlCNR蛋白。
SlCNR促进采后番茄果实的成熟过程
为了评估SlCNR是否调控采后成熟，我们在成熟绿色期收获了野生型（WT）、SlCNR敲除突变体和SlCNR过表达品系的果实，并在25±1°C和80±5%相对湿度下储存16天。如图1A所示，敲除SlCNR的果实采后成熟过程受到抑制，尤其是SlCNR#23品系的表现更为明显。相比之下，过表达SlCNR的果实加速了采后成熟过程。
讨论
番茄红素环化和ABA代谢的调控是控制果实颜色发展的复杂网络中的关键节点（Graves 等，2026；Hong 等，2019）。越来越多的证据表明，番茄红素环化基因（如SlCYC-B（Arruabarrena 等，2023）、SlLCYB2（Na 等，2025）、DkLCYb（Qi 等，2021）和SlLCYE（Wu 等，2022）是调控果实番茄红素含量的关键因子。此外，脱落酸（ABA）及其相关的合成和降解基因也起着重要作用。
结论
总之，SlCNR通过协调番茄红素环化和ABA代谢来调控番茄果实的采后成熟。SlCNR直接抑制番茄红素环化基因SlLCY-E和SlCYC-B的表达，从而影响番茄红素的积累，并通过调控SlNCED1和SlCYP707A2来调节ABA的平衡。通过这些调控作用，SlCNR促进了果实采后的颜色发展、成熟进程等。
CRediT作者贡献声明
张帅：撰写——原始草稿、方法学、实验设计。曲贵勤：撰写——审稿与编辑、监督、项目管理、实验设计、资金获取、概念构思。马立群：撰写——审稿与编辑、方法学。陈迪：方法学。孟明哲：撰写——审稿与编辑、方法学。曹建康：方法学、资金获取。于琳：方法学。胡婷婷：方法学。张世元：方法学。朱洪亮：方法学、资金获取。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
本研究得到了国家重点研发计划（2022YFD2100101）和国家自然科学基金（31972128）的支持。
