基于CRISPR/Cas9系统多模块改造枯草芽孢杆菌强化木质纤维素降解能力的研究

《Synthetic and Systems Biotechnology》：Engineering of multiple modules to enhance lignocellulose degradation ability in Bacillus subtilis using CRISPR/Cas9 system

本研究针对野生型枯草芽孢杆菌纤维素酶系统不完整、活性低的问题，通过CRISPR/Cas9介导的基因组编辑，优化信号肽、转录终止子和染色体整合位点，构建了能高效分泌内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶三重纤维素酶系统的工程菌株BSK3P2C。该菌株在小麦秸秆发酵实验中显著降低半纤维素（16.70%）、中性洗涤纤维（7.46%）和酸性洗涤纤维（9.93%）含量，为木质纤维素生物质的高效转化提供了新策略。

随着全球对可再生能源需求的日益增长，木质纤维素生物质作为最丰富的可再生资源之一，其高效转化技术成为研究热点。这类生物质主要由纤维素、半纤维素和木质素构成，其中纤维素降解是制约其利用效率的关键环节。尽管自然界中许多微生物能够产生纤维素酶，但野生型菌株通常存在酶活性低、纤维素酶系统不完整等问题，限制了其工业化应用。

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）作为一种公认安全的革兰氏阳性菌，具有非致病性、高蛋白分泌能力和易于遗传操作等优点，已成为工业用重组蛋白生产的理想底盘菌。然而，野生型枯草芽孢杆菌168仅具备内切葡聚糖酶活性，缺乏外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶活性，导致其纤维素降解能力有限。近年来，CRISPR基因编辑技术的发展为微生物遗传改造提供了强大工具，但利用该技术构建具有完整纤维素酶系统的枯草芽孢杆菌工程菌株的研究尚不多见。

为解决这一难题，西北农林科技大学动物科技学院的研究团队在《Synthetic and Systems Biotechnology》上发表了一项创新性研究。他们通过CRISPR/Cas9系统对枯草芽孢杆菌进行多模块代谢工程改造，成功构建了能够高效降解木质纤维素的重组菌株。

研究采用CRISPR/Cas9基因组编辑技术，通过优化信号肽（包括Sec途径的bglC、phoB和Tat途径的phoD、lipA、ywbN）、转录终止子（TB4、TB5、TB9、TH1）和染色体整合位点（sprE、lacZ、thrC、nprE），将来自枯草芽孢杆菌RLI2019的内切葡聚糖酶基因G2006和来自激烈热球菌（Pyrococcus furiosus）的双功能纤维素酶基因Bf1（同时具有外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶活性）导入枯草芽孢杆菌168基因组。研究人员构建了多种重组菌株，并通过酶活性测定、生长曲线分析和小麦秸秆发酵实验评估其降解性能。

3.1. 单一位点内切葡聚糖酶的表达与优化

研究首先将G2006表达盒整合到eglS位点，获得菌株BSKI2006，其内切葡聚糖酶活性比野生型提高59.18%。通过比较不同信号肽，发现bglC信号肽效果最佳，菌株BSsprP₄₃BglC2006酶活性提高6.82倍。在筛选整合位点时，sprE位点表达效率最高，酶活性达112.56 U/mL。进一步优化发现TB4终止子和P₁₂启动子组合效果最优，菌株BSsprP₁₂BglC2006TB4酶活性达238.03 U/mL。

3.2. 两个位点内切葡聚糖酶的表达优化

在BSsprP₁₂BglC2006TB4基础上，在lacZ位点整合带有不同信号肽的G2006表达盒。结果显示，同时使用Sec途径信号肽bglC和Tat途径信号肽lipA的菌株BSsprlacLip2006效果最显著，内切葡聚糖酶活性达268.89 U/mL，表明双分泌途径协同增强了蛋白分泌效率。

3.3. 单一位点双功能纤维素酶的表达与优化

研究人员将密码子优化的Bf1基因与不同信号肽组合表达。发现Tat途径信号肽YwbN效果最佳，菌株BSthrP₄₃YwbBfTH1的外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶活性分别达549.77 U/mL和349.26 U/mL。thrC位点整合效率最高，且基因组整合优于质粒表达。

3.4. 两个位点双功能纤维素酶的表达优化

双位点表达Bf1并未显著提高酶活性，可能由于异源蛋白表达过载导致代谢负担。这表明单个优化位点已能满足高效表达需求。

3.5. 复合纤维素酶的表达优化

通过组合优化，研究人员构建了菌株BSKI3Cel（三个基因组整合表达盒）和BSK3P2C（额外添加质粒pJOE2006Bf）。BSK3P2C在培养第8天时，三种纤维素酶活性分别达533.16、2959.83和2829.61 U/mL，表现出卓越的纤维素降解能力。

3.6. 重组菌株发酵对小麦秸秆理化特性的影响

发酵实验表明，BSK3P2C处理8天后，小麦秸秆的半纤维素、中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量显著降低，pH值升高，还原糖含量增加。扫描电镜显示秸秆表面结构变得疏松多孔，傅里叶变换红外光谱证实纤维素和半纤维素特征吸收峰减弱，说明降解效果显著。

该研究成功构建了具有完整纤维素酶系统的枯草芽孢杆菌工程菌株，解决了野生菌纤维素降解能力不足的问题。通过多参数系统优化，实现了三种纤维素酶的高效协同表达。重组菌株在木质纤维素降解方面表现出色，为生物质能源开发和农业废弃物利用提供了高效、安全的微生物平台。这种基于CRISPR/Cas9的多模块代谢工程策略，也为其他工业微生物的定向改造提供了重要参考。