《Synthetic and Systems Biotechnology》：High-throughput editing boosts the construction of next-generation microbial cell factories
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本综述系统梳理了高通量基因组编辑技术（HTP）在微生物细胞工厂构建中的最新进展，重点介绍了转座子、同源重组和核酸内切酶介导的三大类编辑技术机制及其在代谢通路优化、复杂表型筛选等领域的应用。文章指出HTP技术通过CRISPR/Cas9、碱基编辑和引物编辑等工具显著加速了"设计-构建-测试-学习"循环，并展望了人工智能靶点设计、多机制协同编辑及新型微生物反应器系统等未来方向，为可持续生物制造提供关键技术支撑。
2. HTP基因组编辑技术演进图谱
基因组编辑技术从早期的随机诱变发展到如今的高精度操作，经历了革命性变革。20世纪80年代限制性内切酶的发现为基因克隆奠定基础，21世纪初出现的锌指核酸酶和转录激活因子样效应物核酸酶提升了靶向精度，但设计复杂效率有限。2012年CRISPR/Cas9系统的突破性进展，通过RNA引导的DNA切割机制彻底改变了编辑范式。当前HTP编辑技术主要依赖三大核心机制：转座系统、DNA重组和可编程核酸内切酶，实现了从随机插入到精准调控的跨越。
2.1. 转座介导的随机插入策略
转座酶通过识别特异性反向重复序列，将携带的DNA片段随机整合到基因组中。转座子插入测序技术通过构建全基因组敲除库，可用于必需基因鉴定和最小基因组研究。例如Goodall团队通过90万+独特插入的转座子库，揭示了E. coli中新的代谢通路特征。该技术虽具有插入效率高、操作简便的优势，但随机性导致的不可预测性限制了其在精准编辑中的应用。
2.2. 重组介导的精准编辑系统
同源重组和位点特异性重组构成了精准编辑的双引擎。λ-Red系统和RecET系统为代表的HR技术可实现特定基因位点的无缝编辑，而多重自动化基因组工程技术通过寡核苷酸自动化循环可产生数十亿变异体。在真核生物中，合成染色体重排和修改技术通过loxP位点实现染色体结构多样性构建。这些技术虽然精度高，但在非模式生物中仍面临重组效率低的挑战。
2.3. 核酸内切酶驱动的精准操控
CRISPR/Cas系统以其设计简便、成本低廉的优势成为HTP编辑的核心工具。碱基编辑技术通过融合脱氨酶实现无需双链断裂的碱基转换，而引物编辑更可同时实现12种碱基替换和小片段插缺。例如MACBETH技术通过双脱氨酶在C. glutamicum中实现多路编辑，编辑效率超50%。这些工具正在推动微生物细胞工厂从单基因修饰向全基因组规模工程迈进。
2.4. 多机制协同编辑新范式
CRISPR-HR组合技术通过核酸酶精准靶向和重组模板修复，显著降低脱靶效应。工程化大丝氨酸重组酶与dCas9融合实现12kb大片段整合，CRISPR相关转座系统可实现10kb序列的定向插入。这些协同策略为复杂代谢通路的多基因同步优化提供了全新解决方案。
3. 技术挑战与智能化未来
当前HTP编辑仍面临靶点不明确、编辑工具局限性等挑战。未来发展方向包括：通过人工智能辅助靶点设计提升编辑效率；开发PAM无限制的编辑工具扩展靶向范围；结合生物传感器和微流控技术实现大规模表型筛选。多学科交叉创新将推动下一代微生物细胞工厂的高效构建，为生物基可持续生产提供强大技术支撑。
