基于亲和力微流控分选PD-L1高表达间充质干细胞增强自身免疫疾病免疫调节功能的研究

《Small Structures》：PD-L1-Expressing Mesenchymal Stem Cells for Autoimmune Diseases: From Avidity-Based Microfluidic Enrichment to Enhanced Immunoregulation

本文创新性地开发了一种基于树状大分子多价相互作用的微流控分选平台，可实现程序性死亡配体1高表达间充质干细胞（PD-L1HighMSCs）的高灵敏度无标记分选。该技术通过树枝状聚合物-多肽缀合物（G7-pPDL1）构建的亲和界面，在分子水平实现2.5倍于传统抗体的结合力，在微流控环境中成功富集具有显著增强免疫抑制活性的PD-L1HighMSC亚群，为解决MSC疗法异质性难题提供了创新性技术方案。

　　

基于亲和力微流控分选PD-L1高表达间充质干细胞增强自身免疫疾病治疗效能

研究背景与意义

间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells, MSCs）疗法已成为治疗免疫介导疾病的有效策略，通过调节免疫激活和炎症反应发挥治疗作用。然而，MSC固有的细胞异质性和免疫调节效力的不一致性严重限制了其临床转化。程序性死亡配体1（Programmed Death-Ligand 1, PD-L1）作为重要的免疫检查点分子，与MSC的免疫调节功能密切相关。研究表明，PD-L1^HighMSCs表现出更强的免疫抑制能力，但因其在MSC群体中表达水平低且异质性高，传统分选技术如荧光激活细胞分选（Fluorescence-Activated Cell Sorting, FACS）和磁激活细胞分选（Magnetic-Activated Cell Sorting, MACS）存在抗体标记影响细胞功能、细胞存活率低等技术瓶颈。

亲和力微流控分选平台的设计与构建

研究团队设计了一种基于亲和力的微流控分选平台，利用树枝状聚合物介导的多价相互作用实现PD-L1^HighMSCs的高灵敏度富集。该平台的核心创新在于构建了表面固定的树枝状聚合物-多肽缀合物（G7-pPDL1），其中聚酰胺-胺（Poly(amidoamine), PAMAM）树枝状聚合物作为多价支架，将单个肽-受体相互作用放大为强大的整体亲和力。

平台工作原理包括三个关键步骤：首先，MSCs被引入功能化有G7-pPDL1缀合物的微流控流动室，在低流速（50μL/min）下促进结合；随后，通过逐步增加剪切速率（200-1000μL/min）的洗涤过程，选择性去除低PD-L1表达的MSCs；最后，通过温和的蛋白酶解解离（胰蛋白酶-EDTA处理）实现PD-L1^HighMSCs的温和回收，同时保持细胞活力和增殖能力。

分子水平验证与表征

通过生物层干涉技术（Bio-Layer Interferometry, BLI）在分子水平验证了G7-pPDL1表面的结合特性。结果显示，尽管单个pPDL1肽的亲和力低于传统抗PD-L1抗体（aPD-L1），但G7-pPDL1功能化表面表现出显著更高的结合信号强度和结合速率常数（k_a= 1.39×10⁵vs. 1.20×10⁵M^-1s^-1）。这种增强的结合响应归因于pPDL1配体表面密度的增加，以及超支化树枝状聚合物支架中多个肽单元的整合。

在细胞水平，树枝状聚合物介导的多价性通过同时与质膜上的多个PD-L1分子相互作用，进一步放大了与PD-L1表达细胞的结合。使用PD-L1^HighMDA-MB-231细胞制备的膜囊泡进行BLI分析，G7-pPDL1功能化传感器在10¹⁰颗粒/mL浓度下显示出比aPD-L1固定化芯片更强的响应和更快的结合速率。

细胞分选性能评估

研究团队首先通过混合淋巴细胞反应（Mixed Lymphocyte Reaction, MLR）实验验证了PD-L1表达与MSCs免疫抑制活性之间的相关性。结果显示，五种骨髓来源的克隆MSCs（clonal MSCs, cMSCs）中，细胞表面PD-L1表达与T细胞增殖抑制呈强负相关（r = -0.849）。PD-L1表达最高的D407细胞系（PD-L1 ～51.0%）在MSC:T细胞比例为1:20时，显示出显著的T细胞增殖抑制（～53.2%）。

微流控分选性能测试表明，G7-pPDL1表面对PD-L1^HighD407细胞的捕获效率达到88.6±1.3%，显著高于缺乏树枝状聚合物的pPDL1表面（75.3±11.5%）和传统aPD-L1功能化表面（78.3±4.8%）。更重要的是，该平台表现出优异的PD-L1依赖性捕获选择性，对PD-L1^LowD004-1细胞（PD-L1表达～15.8%）的捕获效率仅为27.3±1.6%，而对PD-L1阴性HL-60细胞几乎无捕获。

细胞回收与功能保持

通过温和的胰蛋白酶-EDTA处理3分钟，成功实现了99.7±0.5%的捕获MSCs回收。回收的细胞保持高活力（>97.6±1.1%）和正常的增殖能力。流式细胞术分析显示，G7-pPDL1捕获的MSCs与未经处理的MSCs相比，PD-L1中位荧光强度（Median Fluorescence Intensity, MFI）增加1.23倍，PD-L1阳性细胞比例增加1.23倍，证实了平台对PD-L1^HighMSCs的有效富集。

值得注意的是，与G7-pPDL1系统相比，从aPD-L1功能化表面回收的MSCs表现出明显降低的PD-L1表达，这归因于残留的aPD-L1片段对表面PD-L1检测的空间位阻效应，凸显了抗体介导的细胞分选对表面蛋白功能性的潜在干扰。

免疫抑制功能验证

通过建立MSCs、细胞毒性NK样免疫细胞（KHYG-1）和正常人乳腺上皮细胞（MCF-10A）的三细胞共培养系统，评估了富集PD-L1^HighMSCs的免疫抑制功能。结果显示，与G7-pPDL1捕获的PD-L1^HighMSCs共培养可显著降低MCF-10A细胞的相对碘化丙啶-to-钙黄绿素AM（PI-to-calcein）荧光比率至9%，显著优于未经处理MSCs的效果（43%）。

采用溶液浸没硅（Solution-Immersed Silicon, SIS）椭偏生物传感器定量分析细胞因子分泌，发现PD-L1^HighMSCs处理组的肿瘤坏死因子-α（Tumor Necrosis Factor-alpha, TNF-α）浓度显著降低至0.7ng/mL，而未处理组和未经处理MSCs处理组分别为73.2ng/mL和4.4ng/mL。同时，白细胞介素-6（Interleukin-6, IL-6）分泌也显著降低，表明富集的PD-L1^HighMSCs有效抑制了免疫细胞活化，进而减弱了免疫-MSC炎症串扰。

人原代免疫细胞验证

使用人外周血单核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells, PBMCs）进行的共培养实验进一步验证了富集PD-L1^HighMSCs的免疫抑制效能。CFSE染色显示，与未经处理MSCs相比，PD-L1^HighMSCs显著抑制了CD4⁺和CD8⁺T细胞增殖，未分裂（d₀）细胞比例分别增加1.36倍和1.56倍。

重要的是，PD-L1功能阻断实验证实了MSCs介导的免疫抑制 predominantly 依赖于PD-L1信号通路。抗体阻断PD-L1后，富集PD-L1^HighMSCs的抗增殖效应显著减弱，未分裂CD4⁺和CD8⁺T细胞比例分别降低81.4%和73.2%，T细胞分裂谱部分恢复。

技术优势与临床意义

与常规FACS相比，亲和力微流控分选平台在富集低表达靶标如PD-L1方面展现出显著优势。FACS分选的MSCs在PD-L1表达方面与未处理细胞无显著差异，而本文开发的平台通过树枝状聚合物介导的多价性有效放大了弱结合相互作用，在温和、临床兼容的条件下实现了PD-L1^HighMSCs的高灵敏度富集。

该技术平台的成功建立为解决MSC疗法异质性难题提供了创新解决方案，通过无遗传操作的方式选择性生产具有增强免疫调节功能的MSC亚群，为再生医学和炎症性疾病治疗提供了新的技术路径。未来研究将重点评估在不同疾病模型中的治疗效果，并验证技术在不同组织来源MSCs中的适用性。