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本刊推荐：研究人员针对哺乳动物活体组织蛋白结构研究空白，开展全血自由基蛋白足迹法（RPF）技术攻关。通过在野生型与2型糖尿病（T2DM）小鼠血液中利用FOX光解系统激活过硫酸盐实现蛋白标记，成功捕获11种高丰度蛋白的氧化修饰，揭示补体激活和转铁蛋白铁饱和度升高导致的构象变化，为临床前模型及临床样本结构蛋白质学研究开辟新途径。
在结构生物学研究领域，羟自由基蛋白足迹法（Hydroxyl Radical Protein Footprinting, HRPF）长期以来作为解析蛋白质高级结构的利器，能够精准探测蛋白质三维构象、蛋白质-蛋白质相互作用以及蛋白质-配体结合界面。然而这项技术的应用场景多年来始终局限在体外环境，虽然近年技术发展已成功拓展至活细胞、线虫和三维培养体系，但在哺乳动物活体组织层面的应用始终是难以逾越的技术壁垒。这一瓶颈严重制约了我们在真实生理环境下研究疾病相关蛋白构象变化的可能性。
正是为了突破这一限制，研究团队将目光投向了哺乳动物全血这一包含复杂细胞成分和蛋白质网络的生理系统。血液作为机体最重要的生物样本之一，其蛋白质构象变化与2型糖尿病（Type 2 Diabetes Mellitus, T2DM）等代谢性疾病的发生发展密切相关。然而，由于血液环境中细胞成分敏感、抗氧化系统活跃等技术挑战，传统自由基足迹法难以在维持血液生理状态的同时实现有效标记。
在这项发表于《Nature Communications》的创新研究中，研究人员首次成功建立了哺乳动物全血自由基蛋白足迹法（Radical Protein Footprinting, RPF）技术平台。通过使用FOX光解系统光活化过硫酸盐产生自由基，在野生型和T2DM模型小鼠的全血样本中实现了高效、特异的蛋白质标记。特别值得关注的是，该方法在实现充分标记的同时，最大程度地保持了血细胞的完整形态，避免了溶血等副反应的发生。
关键技术方法包括：利用FOX Photolysis System光活化过硫酸盐产生自由基的蛋白标记策略；针对全血环境优化的自由基淬灭方案以消除背景标记；通过质谱分析检测11种高丰度蛋白的氧化修饰位点；使用野生型和T2DM小鼠全血样本进行对比研究。
全血RPF技术平台的建立与优化
研究人员首先建立了适用于哺乳动物全血的实验方案。通过系统优化过硫酸盐浓度、光照时间和淬灭条件，在野生型小鼠血液中实现了高效蛋白质标记。实验数据显示，该方法对红细胞、白细胞等血液成分的形态影响极小，证明其具有良好的生物相容性。特别重要的是，研究团队开发的高效淬灭方案彻底消除了背景标记，为后续精准分析奠定了基础。
高丰度蛋白的氧化修饰谱分析
研究团队通过质谱技术系统鉴定了血液中11种最丰富蛋白质的氧化修饰位点。这些蛋白包括血红蛋白、血清白蛋白、转铁蛋白等关键功能分子。分析结果显示，不同蛋白质的修饰位点分布具有明显特征，反映了其在血液环境中的空间可及性差异。这一发现为理解蛋白质在生理环境中的三维构象提供了直接证据。
T2DM相关蛋白构象变化鉴定
对比分析显示，T2DM小鼠血液中多个蛋白质呈现出独特的氧化修饰模式。其中补体系统蛋白的修饰谱变化最为显著，提示疾病状态下补体激活途径的异常活化。同时，转铁蛋白的氧化模式改变表明其铁饱和度升高，这与T2DM患者常见的铁代谢紊乱现象相吻合。这些发现为从结构层面理解糖尿病病理生理机制提供了新视角。
疾病特异性结构变化的验证
研究人员通过多种对照验证了观察到的修饰变化确实源于疾病相关的构象改变而非非特异性效应。实验证实，T2DM小鼠血液中补体蛋白的修饰增加与补体激活状态直接相关，而转铁蛋白的修饰模式变化则反映了其铁结合状态的改变。这些结果为RPF技术在疾病生物标记物发现中的应用提供了有力支持。
本研究成功证明自由基蛋白足迹法在哺乳动物全血中应用的可行性，突破了该技术在活体组织应用的技术障碍。研究发现T2DM可引起血液中多种蛋白质的构象重排，特别是补体系统蛋白和转铁蛋白的结构变化为理解糖尿病并发症机制提供了结构生物学基础。这项技术的建立不仅为临床前疾病模型研究提供了新工具，更重要的是为未来临床样本的结构蛋白质学研究开辟了道路，有望推动蛋白质结构分析从体外向体内、从模型系统向真实临床场景的跨越式发展。
