《ASN Neuro》：GABA Receptor Activation in Müller Glia as a Molecular Switch for Controlling VEGF-A in the Retina
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本综述揭示了视网膜 Müller 胶质细胞中一条新的信号通路：GABAA受体激活引起膜去极化，开启L型钙通道导致Ca2+内流，进而激活ERK/MAPK信号通路，从而双向调控血管内皮生长因子 VEGF-A 的合成与分泌。这一发现为理解神经递质如何通过胶质细胞调控视网膜血管稳定性提供了全新视角，对糖尿病视网膜病变等血管增生性眼病的治疗靶点开发具有重要启示。
Abstract
γ-氨基丁酸受体在神经系统中经典的作用是驱动神经元超极化和调节突触传递。然而在胶质细胞中，GABA诱导去极化并触发钙依赖性信号通路。Müller胶质细胞作为主要的视网膜胶质细胞群，维持视网膜稳态，并且是神经视网膜中血管内皮生长因子A的主要来源，这是发育和疾病中的关键血管生成因子。虽然GABA受体活性已被提出会影响视网膜VEGF-A，但这种调节是否通过Müller胶质细胞发生以及涉及哪些机制仍不清楚。本研究探讨了GABA受体激活如何调节原代小鼠Müller胶质细胞培养物中的VEGF-A。研究结果表明，GABA及其GABAA受体选择性激动剂麝香醇在48小时后增加了VEGF-A的荧光强度，同时减少了VEGF-A的分泌，且不改变Vegfa mRNA水平。这两种效应均可被细胞外Ca2+去除或尼莫地平所消除，表明存在一个Ca2+依赖性机制。ERK1/2抑制剂FR180204也能减弱GABA和GABAA受体介导的效应，提示MAPK信号通路参与其中。短期实验显示，GABA能在约30分钟内迅速升高VEGF-A蛋白水平和分泌。这些发现共同确定了一条通过Müller胶质细胞调节VEGF-A产生和释放的、依赖Ca2+和GABAA受体的通路，为胶质细胞信号传导和神经递质驱动的视网膜血管生成因子调控提供了新的见解。
Introduction
Müller胶质细胞是哺乳动物视网膜中最丰富的胶质细胞，执行多种维持稳态的基本功能。Müller细胞表达多种神经递质受体，包括GABA能受体。在胶质细胞中，与神经元不同，GABAA受体的激活会导致去极化，进而打开电压门控钙通道，增加细胞内Ca2+水平。多项研究表明GABA受体在维持视网膜血管稳定性中发挥作用。由于Müller细胞是神经视网膜中VEGF-A释放的主要来源，本研究旨在探讨Müller细胞是否响应GABA受体激活而影响VEGF-A的合成和释放。研究提出了一种新机制，涉及离子型GABAA受体的激活、随后L型钙通道的激活、细胞外Ca2+内流，最终导致ERK/MAPK信号通路的激活。
Materials and Methods
实验使用原代培养的小鼠Müller细胞。细胞暴露于GABA以及GABAA和GABAB受体的选择性激动剂或拮抗剂。通过免疫荧光、蛋白质印迹、RT-qPCR和ELISA分析VEGF-A的表达和分泌。为了评估Ca2+的参与，使用了无Ca2+的Ringer-Krebs溶液和L型通道阻滞剂尼莫地平，并使用ERK1/2抑制剂FR180204检测MAPK信号。
Results
GABA通过GABAA受体调节Müller细胞中的VEGF-A
剂量反应实验显示，50和100 μM的GABA能显著增加VEGF-A荧光强度，而200 μM GABA则降低之。单细胞荧光强度分布直方图显示GABA选择性地在一部分Müller细胞群体中上调了VEGF-A。蛋白质印迹证实100 μM GABA处理增加了细胞内VEGF-A，但Vegfa mRNA水平无变化。相反，ELISA显示GABA处理后VEGF-A分泌显著减少。这些结果表明GABA导致VEGF-A蛋白在Müller细胞内积累，阻止其释放。
GABAA受体拮抗剂抑制GABA诱导的VEGF-A调节
GABA与GABAA受体拮抗剂加巴喷丁共孵育，可减弱GABA对VEGF-A的调节作用，而与GABAB受体拮抗剂CGP55845共应用则不影响。GABAρ受体拮抗剂TPMPA不能消除GABA的效应。这表明GABA对VEGF-A的调节主要由GABAA受体介导。
选择性GABAA受体激活调节VEGF-A
使用选择性激动剂麝香醇激活GABAA受体，可模仿GABA的作用，增加VEGF-A荧光强度并减少其分泌，这些效应可被加巴喷丁阻断。而GABAB受体激动剂巴氯芬虽影响VEGF-A释放，但不改变荧光强度。这进一步证实GABAA受体在GABA-VEGF-A信号通路中的关键作用。
细胞外钙离子对GABAA受体诱导的VEGF-A调节至关重要
在无Ca2+的溶液中，GABA引起的VEGF-A荧光强度增加被取消，VEGF-A分泌也得以恢复。使用L型钙通道阻滞剂尼莫地平也能抑制GABA诱导的VEGF-A荧光强度增加，并阻止GABA引起的分泌减少。这表明细胞外钙离子通过L型钙通道的内流在GABAA受体介导的VEGF-A调节中扮演重要角色。
MAPK信号通路参与GABAA受体诱导的VEGF-A调节
使用ERK1/2激酶活性抑制剂FR180204，可阻止GABA引起的VEGF-A荧光强度增加，并恢复Müller细胞中的VEGF-A分泌。这表明ERK1/2磷酸化是Ca2+信号下游的关键步骤。
GABA能刺激增加Müller细胞核内HIF-1α免疫反应性
用100 μM GABA或麝香醇处理48小时，Müller细胞核内HIF-1α信号显著增加。HIF-1α是关键的转录调节因子，可促进VEGF-A等促血管生成基因的表达。
GABA诱导Müller细胞快速释放VEGF-A
时间进程分析显示，暴露于100 μM GABA约30分钟后，VEGF-A荧光强度和分泌均显著增加，而此时Vegfa mRNA水平无变化。这表明GABA通过Ca2+依赖性机制快速动员并释放预先存在的VEGF-A库，而非新的转录上调。
Discussion
药理学实验表明，VEGF-A的效应主要由离子型GABAA受体介导。研究中产生最大效应的GABA浓度与疾病状态下的水平相关，例如增殖性糖尿病视网膜病变患者玻璃体中GABA水平升高。数据表明细胞外Ca2+内流对于GABAA受体诱导的VEGF-A调节至关重要，这一过程依赖于GABAA受体介导的去极化下游的L型钙通道的激活。阻断ERK1/2激酶活性显著降低了GABA诱导的VEGF-A变化，表明ERK1/2磷酸化是Ca2+信号下游的关键步骤。
在胶质细胞中，由于Na+-K+-2Cl-协同转运蛋白驱动的细胞内Cl-积累，GABAA受体的开放是去极化而非超极化。这种去极化可激活电压门控钙通道，导致细胞外Ca2+快速内流。当细胞内Ca2+水平升高时，典型的Ca2+/钙调蛋白依赖性信号通路可能导致MAPK/ERK激活。
观察到GABA应用后约30分钟，细胞内VEGF-A免疫反应性和分泌的VEGF-A快速增加，同时点Vegfa mRNA无变化，这强烈提示通过Ca2+和GABAA受体依赖性机制动员和释放预先存在的VEGF-A库，而非新的转录上调。这种快速的时间过程支持了一种即刻的胶质分泌反应，可能具有直接的生理或病理生理效应。
本研究描述的级联反应与少突胶质细胞谱系细胞和一些分泌内分泌系统中所见的机制相似。然而，神经递质受体与血管生成生长因子的受控释放之间的联系在视网膜胶质细胞中尚未见报道。因此，这些发现拓宽了对胶质细胞分泌功能的理解，并暗示神经递质受体可以直接影响神经血管信号。
由于Müller细胞是视网膜VEGF-A的主要来源，并且处于检测突触和血管微环境的位置，GABAA受体依赖性的VEGF-A调节可能具有重要后果。正常情况下，Müller细胞响应神经元GABA能活动而快速局部释放VEGF-A可能支持神经血管耦合或提供短期营养效应。然而，在以细胞外GABA升高为特征的疾病状态下，如缺血或糖尿病视网膜病变，GABA能对Müller细胞的持续激活可能扰乱VEGF-A平衡，导致血管渗漏或新血管形成。
研究发现揭示了一个动态的“GABA开关”，控制着VEGF-A的可用性。在正常条件下，VEGF-A的快速释放可能促进神经血管耦合。相反，在GABA持续增加的疾病中，向细胞内VEGF-A积累的转变表明了一种适应性反应。这种细胞内储存具有双重目的：限制可能损害血-视网膜屏障的过量VEGF-A释放，同时创建一种神经保护储备。因此，GABA能激活L型钙通道就像一个变阻器，调整VEGF-A平衡，以在代谢应激期间促进神经元存活并降低血管通透性。
这项研究是在原代小鼠Müller细胞培养物中进行的，因此需要体内验证以确定其生理相关性和组织水平效应。未来的研究应致力于识别Müller细胞中特定的GABAA受体亚基组成，阐明连接ERK1/2激活与VEGF-A运输和分泌的分子机制，确定该通路在完整视网膜和视网膜疾病模型中是否起作用，以及评估药理学调节Müller细胞中的GABAA受体信号是否可用于治疗，以在不破坏视网膜稳态的情况下减少病理性血管生成。
总之，本研究数据揭示了一种先前未知的机制，通过该机制，GABA能信号控制着Müller细胞中的Ca2+–ERK1/2–VEGF-A轴。这些发现表明，Müller细胞中的GABAA受体不仅参与维持离子平衡，还参与整合神经血管信号，将Müller胶质细胞定位为连接神经传递和视网膜血管生成的中央枢纽。理解该通路的体内作用及其在血管增生性视网膜病变中的治疗潜力是未来研究的一个重要领域。
