《Emerging Microbes & Infections》：Rapid drug resistance prediction in positive Mycobacterium tuberculosis clinical samples using an extensive targeted next-generation sequencing panel
Abstract
结核病（Tuberculosis, TB）仍然是全球性的健康挑战，而耐药结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）菌株的出现使其进一步恶化。大多数药物敏感性测试（Drug Susceptibility Testing, DST）方法依赖于培养且耗时，可能延迟最佳结核病治疗的开始。本研究旨在开发一种广泛的靶向下一代测序（targeted Next-Generation Sequencing, tNGS）方法，用于直接从临床样本进行快速的基因型DST（genotypic DST, gDST）。我们设计了一个包含30个扩增子的tNGS panel，靶向与20种抗生素耐药性相关的19个基因组区域。该方法应用于在葡萄牙国家参考实验室收集的71份涂片阳性（0–3+）肺结核临床样本。提取DNA后使用多重PCR进行扩增，随后在Oxford Nanopore Technologies MinION平台上进行测序。使用TB-Profiler分析测序数据，并将tNGS结果与来自相应分离株的表型DST（phenotypic DST, pDST）和全基因组测序（Whole Genome Sequencing, WGS）数据进行比较。tNGS在不同样本类型和涂片阳性水平上均显示出与pDST和基于WGS的DST的高度一致性。对于一线药物，tNGS与pDST的分类一致性（Categorical Agreement, CA）为88%，当排除未确定结果后，CA增加至97%。与WGS在所有分析的抗生素上相比，tNGS实现了92%的CA，排除未确定结果后增加至>99%。tNGS panel的验证显示，90%（1,895/2,076）的扩增子在所有分析位点达到>10x覆盖度，43份（61%）样本的所有完整扩增子均高于此阈值。污染物细菌DNA的非特异性扩增极少，大多数脱靶读数来源于人类。该方法能够直接从临床样本进行全面的耐药性预测，标志着结核病诊断和耐药性监测的重要进展。
Introduction
结核病仍然是我们最紧迫的公共卫生问题之一。活动性结核病主要表现为肺部疾病，如果不治疗死亡率很高，2023年导致约125万人死亡。结核病治疗因耐药结核分枝杆菌菌株的出现而变得复杂。快速诊断，包括药物敏感性测试（DST），对于指导最佳治疗方案和防止进一步耐药性发展至关重要。
结核分枝杆菌DST的金标准是基于培养的表型测试（pDST）。虽然可靠且成熟，但其局限性在于周转时间长（2至3个月）和实验室生物安全要求（BSL-3），可能延迟最佳结核病治疗。虽然结核分枝杆菌的全基因组测序（WGS）可以为早期阳性培养物提供鉴定和基因型DST（gDST），但它仍然受到培养需求的限制。尝试在测序前直接从临床样本中富集结核分枝杆菌基因组（例如，分子捕获）已被证明有用，但仍然受到灵敏度问题和相对较高成本的限制。
为了克服其中一些限制，已经开发了直接用于临床样本的靶向分子诊断解决方案，包括实时PCR检测、线性探针检测（Line Probe Assays, LPA）、基于杂交的检测和靶向下一代测序（tNGS）。这些检测通常侧重于特征明确的耐药相关靶点，例如rpoB（利福平）、katG和inhA（异烟肼）、gyrA/gyrB（氟喹诺酮类）、pncA（吡嗪酰胺）和rrs（氨基糖苷类）。随着测序技术变得更加先进和成本效益高，tNGS正在成为结核分枝杆菌gDST的可扩展且灵敏的选择，与其他分子检测相比，提供更广泛的突变检测和改进的异质性耐药识别能力。世界卫生组织（WHO）2024年结核病综合指南认可了两款商业tNGS试剂盒（Deeplex? Myc-TB和AmPORE-TB?），可分析6至10种选定的一线和二线抗生素的耐药性。
虽然缩短了结果获取时间，但当前的tNGS解决方案通常靶向有限数量的短基因组区域（所谓的热点），侧重于有限数量的药物。此外，可用的商业试剂盒在低或中等资源环境中可能成本过高，并且不允许根据具体情况调整靶点。同时，商业试剂盒通常不提供检测到的特定突变信息，有时检测亚群或异质性耐药的能力有限。总之，这凸显了开发替代性、低成本的tNGS解决方案的必要性，以实现更广泛、更易获得的结核分枝杆菌DST。
在本研究中，我们开发了一种用于结核分枝杆菌gDST的tNGS方法，包括30个扩增子，靶向19个具有已知耐药相关突变的感兴趣基因组区域，涉及20种用于治疗结核病的抗生素。我们使用具有不同耐药谱的71份临床肺结核样本评估了该panel，并使用pDST和WGS数据作为参考。
Methods
Clinical samples
我们使用了2020年至2024年间葡萄牙肺结核患者的确诊涂片阳性样本。样本的选择基于可用性，以最大化样本类型和表型耐药模式的代表性。这些样本包括痰样本（n = 54）、支气管分泌物（n = 10）、支气管灌洗液（n = 3）、呼吸道分泌物（n = 1）、呼吸道分泌物抽吸物（n = 1）、支气管肺泡灌洗液（n = 1）和气管抽吸物（n = 1）。这些样本是在葡萄牙国家健康研究所（NIH）国家参考结核病实验室（NRL-TB）作为常规诊断的一部分收集的。样本使用N-乙酰半胱氨酸-NaOH BD BBL? MycoPrep?试剂盒按照制造商说明进行去污染，并用作液体和固体培养物以及随后pDST的接种物。通过显微镜检查样本，并根据WHO指南对抗酸杆菌（AFB）评分（1+, 2+, 和3+）进行视觉量化，另外定义0+为每100个显微镜视野1-9个AFB。剩余样本在-20°C保存直至DNA提取。
pDST
所有分离株均接受针对一线药物利福平（RIF）、异烟肼（INH）、乙胺丁醇（EMB）、吡嗪酰胺（PZA）和链霉素（STM）的pDST。被发现至少对RIF和INH耐药的分离株被认为是耐多药结核病（Multidrug-Resistant TB, MDR-TB），并接受针对卡那霉素（KAN）、阿米卡星（AMK）、卷曲霉素（CAP）、乙硫异烟胺（ETH）、对氨基水杨酸钠（PAS）、环丝氨酸（CYCLO）、利奈唑胺（LZD）、贝达喹啉（BDQ）、氯法齐明（CFZ）、德拉马尼（DLM）、莫西沙星（MFX）、左氧氟沙星（LFX）、氧氟沙星（OFX）、环丙沙星（CIP）的pDST。pDST在自动化液体培养基系统Bactec MGIT960上进行，使用以下药物浓度（μg/ml）：STR:1.0；INH:0.1；RIF:1.0/0.5（临界浓度根据WHO 2021年2月的修订更新为0.5 μg/ml）；EMB:5.0；PZA:100.0；OFX:2.0；AMK:1.0；CAP:2.5；KAN:5.0；ETH:5.0；PAS:4.0；CYCLO:16.0；LZD:1.0；BDQ:1.0；CFZ:1.0；DLM:0.06；MFX:0.25；LFX:1.0。
DNA extraction
去污染后的样本在95°C热灭活30分钟。使用QIAamp DNA Mini Kit按照组织总DNA提取方案进行DNA提取；将250 μl临床样本加入裂解缓冲液（ATL）和蛋白酶K中，在56°C振荡孵育过夜，然后按照制造商说明进行提取。使用Qubit 4 Fluorometer和Qubit dsDNA High Sensitivity (HS) Assay Kit测定DNA浓度。
Primer design and multiplex PCRs
使用Primer3通过Benchling设计引物，靶点距离已知耐药性突变至少100个核苷酸。扩增子目标长度为900-1100 bp，引物长度为22 bp，解链温度约为64°C。为防止脱靶扩增，手动检查引物候选物与人类基因组的交叉反应性，并使用BLAST+进行筛选。
多重PCR pool旨在每个反应包含10-12条引物，以尽量减少引物二聚体，并优化退火温度兼容性和扩增效率。从初始设计到最终方案，进行了4-5轮单个PCR优化和3-4轮多重pool优化。总共优化产生了三个多重PCR。值得注意的是，方案在优化过程中进行了更新，只有35个样本使用包含embB的最终优化方案进行扩增。
使用HotStarTaq Plus Master Mix进行PCR，反应体积50 μl，使用10 μl 5x Q-solution和12.6 μl DNA每反应。在文库制备前，通过琼脂糖凝胶电泳（1%琼脂糖，100 V，40分钟）筛选PCR条带。条带被视觉分类为强、中、弱或非常弱/无条带，这些分类决定了三个pool的混合比例。
Library preparation
使用Native Barcoding Kit 24 v14，按照“连接测序扩增子”方案进行，根据制造商说明操作，无DNA对照样本。简而言之，将三个PCR pool的混合物作为End-prep的输入（12.5 μl）。此后，测定每个样本的DNA浓度，并对下一步（Native barcoding ligation）的输入进行标准化。每个样本使用130 ng DNA，或将所有样本的输入标准化至浓度最低的样本（总DNA不低于7.5 ng）。最终文库稀释至20 fmol。
Amplicon sequencing
使用MinION设备和R10.4.1流动池进行测序。根据制造商说明准备流动池，每次运行包含5至24个带条形码的样本。根据剩余可用孔数，清洗并重复使用流动池以测序更多样本。使用Guppy v6.4.6和高精度basecalling模型进行basecalling。使用Artic Network RAMPART工具和自定义方案在整个运行过程中监控每个扩增子和样本的测序覆盖度。
WGS
使用先前获得的WGS数据进行验证（如果可用）。从相应样本生长的分离株是在葡萄牙NIH的NRL-TB作为常规诊断和监测的一部分产生的，WGS按照先前描述的方法进行。简而言之，样本进行Nextera XT文库制备，并在Illumina MiSeq或NextSeq仪器上进行双末端测序。
Sequence data analysis and gDST
使用Porechop进行接头和条形码修剪，使用NanoFilt过滤掉长度<500 bp且平均读取质量得分<10的reads，并修剪两端各50 bp以去除引物区域。使用Kraken2和Standard-16 16 GB数据库对reads进行物种分类以识别潜在污染。为了评估靶向测序的成功率，使用minimap2将测序reads映射到包含所有靶向基因组位点（扩增子）的多重fasta参考文件，并使用SAMtools评估覆盖深度。
对于WGS和tNGS数据，使用TB-profiler v6.2.0和默认设置进行gDST和变异调用。然后，基于所有与测试抗生素相关的感兴趣位点（Positions of Interest, POI）的质量控制后的覆盖深度，使用内部分析脚本将这些结果进一步分类为有效（敏感/耐药）或未确定。POI包括我们的扩增子覆盖的所有在TB Profiler数据库中列出的突变，包括WHO I类和II类突变（不包括缺失）。对于氨基酸替换，考虑所有三个核苷酸。所有POI的覆盖深度≥10x被分类为有效，而该抗生素的单个POI覆盖度低于此阈值则被分类为未确定。
Data analysis and statistics
使用R v.4.3.2和GraphPad Prism v.10.3.0进行数据分析和统计。使用epiR R-package v.2.0.74计算敏感性和特异性，包括95%置信区间。使用普通单因素ANOVA和Tukey方法进行多重比较调整来比较不同涂片阳性，使用非配对t检验比较样本类型。
Ethical statement
本研究遵守所有相关的伦理法规。研究使用了葡萄牙NIH NRL-TB先前用于诊断目的和抗生素耐药性检测的临床样本，遵循医院医生发出的正式医疗请求。这些临床程序的知情同意仅在医院层面获得，葡萄牙NIH不参与此过程，也无法访问同意书；它只收到临床申请。在本研究中，NRL开发的检测方法的准确性评估涉及严格为与原临床医生请求相同的目的操作样本：结核病检测和耐药性预测，因此不需要额外的许可。
Results
Amplicon design and antibiotic targets
我们开发了一种基于扩增子的靶向测序方法，靶向19个与20种抗生素耐药性相关的基因/区域，并在71份确诊肺结核患者的临床样本上进行了评估。对于gDST确定，并行使用开源流程TB-Profiler和定制的生物信息学分析来补充结果，有助于验证方案和解释结果。
Clinical samples and sequencing
样本作为葡萄牙NIH NRL-TB常规诊断的一部分收集，包括痰样本和其他样本类型，具有不同的涂片阳性/AFB评分（0-3+）。总共20份（28%）样本显示出一定程度的表型耐药性，其中对异烟肼（INH）的耐药性最为常见。四份痰样本是MDR（对INH和RIF耐药），对这些样本进行了扩展的表型DST panel，包括16种额外的抗生素。
每个样本产生18,322至351,046条reads（平均128,503条），靶向结核分枝杆菌的reads比例范围为0.3-99.2%。从tNGS获得的每个扩增子的平均深度从零到61,410x不等。在所有扩增子中，75%（1,562）在所有位点的测序覆盖深度>100x，84%（1,751）>30x，91%（1,895）>10x。具有完全覆盖的扩增子的中位比例在>30x时为97%，在>10x时为100%；33/71份样本（46%）的所有扩增子在>30x深度下具有完全覆盖，43/71份样本（61%）在>10x深度下具有完全覆盖。
High concordance between tNGS results and pDST
我们开始将tNGS方法的gDST结果与一线抗生素INH、PZA、EMB和RIF的pDST谱进行比较。使用我们的tNGS方法，理论上预期有248个抗生素谱。我们捕获了224个（90%），而其余24个（10%）谱被归类为未确定。
对于218个谱，gDST和pDST结果之间存在匹配，导致所有谱的分类一致性（CA）为88%，排除未确定结果后为97%。
tNGS-gDST与pDST对单个抗生素的分类一致性（包括和排除未确定结果）如下：INH（78%/92%）、PZA（97%/100%）、EMB（97%/97%）和RIF（85%/100%）。将未确定结果的阈值调整为低于30x覆盖深度，将使未确定谱的数量增加到40个（16%），导致总体分类一致性为82%，敏感性和特异性仅有微小改善。
对于四株MDR分离株，包含48个抗生素谱，将tNGS结果与扩展抗生素panel的pDST进行了比较，总体CA为89%，排除未确定结果（单个谱）后为93%。在耐药表型（一线和二线抗生素）中，有五个被tNGS分类为敏感（INH, n = 3; EMB, n = 1; CYCLO, n = 1）。相反，gDST将两份样本分类为INH耐药，另一份分类为对MFX/LFX、AMK和CAP耐药，尽管这些样本表现出敏感表型。
Resistance mutations identified by tNGS closely match those found by WGS
对于有WGS数据可用的样本（n = 53），我们比较了tNGS和WGS对TB profiler包含的所有抗生素的gDST结果，总共822个抗生素谱。我们的tNGS方法正确分类了756个谱，有四个谱与WGS结果错误分类，62个（8%）谱未确定，导致总体分类一致性为92%，排除未确定谱后为99.5%。
将未确定结果的阈值调整为低于30x覆盖深度，将使未确定谱的数量从8%增加到15%（127个），遗漏了两个INH耐药谱。这导致所有谱的分类一致性为84%，没有减少不一致谱或明显提高特异性。
对于11个表型和tNGS结果不一致的谱，有8个有WGS数据。对于五个谱（INH=2, CYCLO=1, MFX=1, LFX=1），WGS结果与tNGS一致。对于其余三个谱，tNGS识别出的耐药突变也在WGS数据中观察到，但未通过质量控制（AMK=1, KAN=1）或WGS识别出的主要耐药突变位于我们panel未覆盖的基因中（EMB=1）。
Detection of non-resistance associated mutations
为了进一步验证我们的结果，我们分析了panel覆盖区域内与耐药性无关的突变。总共，WGS在41个独特位点识别出260个突变。我们的tNGS方法正确识别了231个（89%）突变，而14个（5%）未被tNGS识别，15个（6%）位点仍未确定。将阈值提高到>30x覆盖深度，将正确识别的突变数量减少到218个（84%），有12个（5%）突变未被检测到，同时使未确定位点数量翻倍至30个（12%）。使用10x阈值识别的13个额外突变中有12个位于突变热点，表明这些可能不是随机测序错误的结果。
我们通过tNGS识别出95个WGS数据中不存在的突变（可能的假阳性结果）。为了进一步探索这些，我们比较了真阳性突变和可能假阳性突变的测序深度和测序分数。我们发现，仅用较低阈值（10x）识别的53个tNGS独有突变存在于单个样本中，且带有该突变的reads比例较低。该样本的结核分枝杆菌reads比例较低（2%），所有突变都存在于gyrA和rrs中，这两个基因已知与其他细菌物种具有同源性。总之，这表明在单个扩增效果差的样本中存在低水平污染，而不是测序错误。
与两种方法都识别的突变（真阳性）相比，其余42个tNGS独有突变（30x阈值）中的27个以相对较低的比例（<75%的reads）呈现，且测序深度足够（>100x）。这27个突变来自9个样本的14个不同基因，表明它们可能代表在培养过程中被选择淘汰的遗传异质性。
Sequencing coverage is not strongly influenced by sample type or smear positivity level
为了评估影响测序覆盖度的因素，我们分析了在不同样本类型和涂片阳性水平下覆盖深度>100x的扩增子。虽然较高的涂片阳性显示出覆盖度增加的趋势，但差异不显著。同样，痰样本和其他样本类型之间未观察到显著差异，尽管每种非痰类型的数量较少限制了可解释性。这些发现表明，涂片阳性或样本类型本身并不能解释测序性能的变异性，尽管可能需要更大的样本集来进行明确评估。
具有较高总reads数的样本通常具有较高比例的覆盖深度>100x的扩增子。在样本中，73%（n = 58）的映射reads中>50%对应于结核分枝杆菌。人类DNA是主要的污染物，非特异性细菌/病毒扩增极少。考虑到rrs、rrl、rpoB和gyrA/B与其他细菌的同源性，这一点很重要。只有3个样本有>10%（17-33%）的非人类/结核分枝杆菌reads，主要被鉴定为普雷沃菌属（n = 1）、假单胞菌属（n = 1）和链球菌属（n = 1），但对gDST结果没有明显影响。
我们还分析了跨扩增子的平均覆盖深度。通常，pool 3中的扩增子显示出略低的平均覆盖深度，尽管用于确定混合比例的琼脂糖凝胶上的视觉条带分类在pool之间没有系统性差异。尽管如此，除四个扩增子（katG.4, ald.1, rpoB.2和rrs.1）外，所有扩增子在>75%的所有样本中平均覆盖深度>100x。
Time and cost requirements
当样本到达葡萄牙NRL-TB时，会在24-48小时内进行去污染，并用于涂片镜检和分子诊断。我们的tNGS方法使用剩余样本，随后进行DNA提取和多重PCR（1.5天，手动操作约2小时）、文库制备（1天，手动操作约2小时），最后是测序和分析（1天，手动操作约2小时）。总之，针对20种抗生素的完整panel的基于tNGS的gDST结果可能在样本接收后五天内获得。这与pDST和基于WGS的gDST所需的时间形成鲜明对比，后者取决于结核分枝杆菌菌株的生长速度，可能需要2到15周。当前这种tNGS方法的估计成本约为每样本40-100欧元，具体取决于NGS平台和每次运行的样本数量。相比之下，每样本WGS成本约为250欧元，完整抗生素组的pDST估计成本可能高达40-70欧元。
Discussion
我们设计了一种用于结核分枝杆菌的基于扩增子的靶向测序方法，并直接在确诊肺结核患者的临床样本上进行了评估。我们证明了与pDST和WGS的高度一致性（分类一致性为97%至>99%，具体取决于参考方法），同时显著缩短了结果获取时间和相关成本。此外，该方法学的灵活性允许动态适应新的遗传抗菌药物耐药性标记。虽然我们选择ONT技术（MinION）进行测序是因为其多功能性和速度，但扩增子设计与其他测序技术（如Illumina）兼容。整个工作流程可在五天内完成，与传统培养方法相比，显著缩短了周转时间。
与先前的研究或当前可用的商业试剂盒相比，我们的研究提出了最全面的panel之一，尤其是在直接在临床样本上验证的那些研究中。我们的panel靶向广泛的抗生素，也包括二线抗生素和较新的药物如DLM/PMD，反映了耐药性和治疗方案的演变格局。panel的靶点选择基于WHO 2023年更新目录。根据该目录，14个基因或区域可能携带与INH、RIF、EMB、PZA、MFX/LFX、CIP、BDQ/CFZ、AMK、CAP、KAN、ETH/PTO耐药相关的I类突变。我们还包含了两个含有与LZD和DLM/PMD耐药最相关区域的II类突变基因。然后根据环丝氨酸和PAS耐药突变的实质性证据，添加了TB Profiler数据库中的另外四个基因。
进行了彻底的设计和多轮优化以确保良好的覆盖度。大多数引物对在单个PCR和后来的多重pool中表现良好，尽管结核分枝杆菌基因组的GC富集区域存在已知挑战。然而，由于这项工作是在资源有限的情况下作为内部诊断开发的一部分进行的，如果扩展或调整靶点集合，还有进一步优化的潜力。
总共，33个表型耐药谱中有五个被tNGS分类为敏感，即INH（n = 3）、CYCLO（n = 1）和EMB（n = 1）。对于有WGS数据可用的CYCLO和一个INH耐药谱，我们的tNGS结果与相应分离株的WGS结果一致。表型和基因型DST之间的不一致先前已有报道，特别是对于INH，可能表明存在未表征的耐药机制。
被tNGS分类为EMB敏感的样本，根据两个突变被WGS鉴定为耐药，与表型结果一致：embB:p.Met306Val（17%的reads）和embA:c.-16C>G（82%的reads）。虽然embC-embA的基因间区域已被认为对EMB耐药很重要，但WHO 2023年目录未将任何embA突变归类为与耐药相关。由于该分离株在表型上是EMB耐药，embA可以考虑纳入扩展panel。该分离株embB的低流行突变在手动检查tNGS数据时也被观察到，如果以更高比例存在则会被检测到。
使用<10x的阈值来定义未确定结果。为了考虑ONT测序的潜在错误倾向，我们使用更保守的>30x阈值进行了分析。我们的结果没有显示出测序错误影响结果的明显迹象。相反，在10x而非30x下检测到的两个额外的pDST-tNGS不一致谱，其WGS数据结果与tNGS数据一致，并且仅由tNGS检测到的额外非耐药相关突变可能代表单个扩增效果差的样本中的低水平细菌污染。然而，需要像其他研究那样直接验证测序平台，以完全排除平台特异性偏差。有趣的是，我们发现即使tNGS谱被归类为未确定，TB profiler也成功识别了四个耐药pDST/WGS谱中的三个。这凸显了部分测序数据的附加价值。
研究的局限性包括：只有四份样本包含超出一线抗生素的pDST谱，且WGS数据仅适用于75%的样本，限制了对一些pDST-gDST差异的洞察。每种样本类型的标本数量很少，且受临床可用性限制，限制了对个体非痰样本类型的可靠结论。同样，研究中未包含涂片阴性样本，尽管已知它们有助于结核病传播，并且从此类样本进行靶向测序已被
