《Emerging Microbes & Infections》：Age-associated differences in XBB.1.5 trivalent booster vaccine-induced adaptive responses revealed by single-cell RNA sequencing
编辑推荐：
本研究通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术，系统揭示了年轻与老年人群接种XBB.1.5三价重组蛋白加强疫苗（WSK-V102C）后适应性免疫应答的年龄相关差异。研究发现，老年个体表现为记忆B细胞优势性活化、CD4+T细胞受体（TCR）多样性受限及转录轨迹改变，而年轻个体则呈现幼稚B细胞高效激活、B-T细胞协同作用增强及KLF7/CEBPB等转录因子富集的免疫协调模式。该研究为理解年龄对变异株适应性疫苗免疫应答的影响提供了单细胞水平的深入见解。
Abstract
尽管经过多次疫苗接种，老年人仍面临严重SARS-CoV-2感染的高风险，然而针对更新版COVID-19加强疫苗的免疫应答年龄差异尚未完全阐明。本研究对22名年轻个体（<38岁）和20名老年个体（≥73岁）接种XBB.1.5三价重组蛋白加强疫苗（WSK-V102C），所有参与者此前均接种过2-3剂灭活COVID-19疫苗。通过定量比较不同年龄组对多种SARS-CoV-2变异株的中和抗体应答，并结合接种前及接种后28天采集的外周血单个核细胞（PBMCs）进行单细胞RNA测序，系统解析了加强免疫后年龄相关的免疫特征。结果显示，加强免疫后两组人群针对所有测试毒株的抗体滴度均显著升高，但老年个体的抗体倍数增加幅度始终低于年轻个体。单细胞分析进一步揭示了疫苗接种后免疫组织的年龄差异：老年个体的B细胞状态转变表现为记忆B细胞向浆母细胞分化的转录特征，而年轻个体则以幼稚B细胞激活为主；老年个体的CD4+T细胞表现出改变的转录轨迹和降低的T细胞受体多样性。相比之下，年轻个体显示出协调的B细胞和T细胞相关转录程序，包括KLF7、CEBPB、CEBPB和MAFB等转录因子的富集。该研究描述了XBB.1.5加强疫苗接种后免疫协调和细胞应答模式的年龄相关差异，为后续机制研究和临床转化提供了重要依据。
引言
老年人即使在全球疫苗接种运动后仍面临COVID-19重症和死亡的高风险。年龄相关的免疫系统变化与疫苗应答改变相关，可能导致突破性感染和不良临床结局的持续负担。尽管COVID-19疫苗广泛接种，但越来越多的证据表明体液和细胞免疫应答存在年龄相关差异，但其潜在免疫学特征尚未完全明确。2022年底出现的SARS-CoV-2 XBB谱系及其快速全球传播进一步凸显了这些挑战。尽管XBB与Omicron BA.2.86共同传播，并在2024年中被JN.1取代，但近期数据显示XBB诱导的免疫应答对JN.1及相关亚变种仍具有交叉保护潜力。在此背景下，迫切需要有效的加强策略——特别是针对老年人——以应对持续的免疫逃逸和再感染风险。世界卫生组织目前建议高风险人群（包括老年人）每6-12个月接种一次COVID-19加强针以维持保护性免疫。然而，关于≥70岁个体对变异株特异性疫苗的细胞和分子特征数据仍然有限。
年龄相关的免疫能力下降与多种疫苗效果减弱相关。这种减弱不仅源于与衰老相关的生理变化，还源于老年人免疫系统的内在改变。衰老常伴随慢性低度炎症状态（称为炎症衰老）。慢性炎症加速免疫细胞衰老，导致免疫功能受损和清除衰老细胞及炎症介质的能力下降。疫苗效力取决于保护性抗体的产生，这一过程由B细胞和CD4+T细胞之间的相互作用协调。B淋巴细胞和T淋巴细胞均起源于骨髓中的造血干细胞，其再生能力随年龄增长而下降。胸腺对T细胞发育至关重要，但随年龄增长逐渐萎缩和退化，导致T淋巴细胞数量显著减少和抗原受体多样性受限。T细胞衰老的进一步特征包括共刺激分子（如CD27和CD28）的下调，以及老年个体幼稚CD4+T细胞在激活时倾向于分化为短寿命效应T细胞而非记忆T细胞。抗原特异性候选T细胞克隆库不足可能导致老年人对灭活SARS-CoV-2疫苗的免疫应答较慢。衰老同样损害B细胞功能，导致总B细胞数量和亚群多样性减少，进而降低浆细胞输出、缩小B细胞受体库并削弱疫苗诱导的抗体应答。此外，年龄相关B细胞显示通过减弱生发中心反应中的亲和力成熟来削弱疫苗应答。多项研究报道了mRNA和灭活疫苗诱导的中和抗体存在年龄依赖性下降。
尽管这些研究提供了关键见解，但大多在原始毒株或早期Omicron毒株背景下进行，使用灭活或mRNA疫苗平台。随着免疫逃逸变异株（如XBB.1.5）的出现和变异株适应性疫苗的全球部署，这些更新配方免疫应答年龄异质性的机制基础仍不明确。特别是缺乏比较年轻和老年个体对XBB.1.5适应性疫苗应答的单细胞转录组数据，这些数据可揭示免疫亚群组成、激活程序和细胞间通讯网络的年龄特异性变化。
WestVac Biopharma的Coviccine?三价XBB疫苗（WSK-V102C）是全球首个获批紧急使用针对XBB.1.5变异株的疫苗。临床研究表明，该疫苗对多种SARS-CoV-2变异株均能引发强劲的中和抗体应答，与早期二价Omicron疫苗相比具有高血清转化率和良好的免疫原性特征。然而，这些应答在年龄组间的差异程度——特别是在抗原特异性T细胞和B细胞功能水平上——尚未得到很好表征。
为填补这些空白，本研究对WSK-V102C的外周免疫应答进行了全面单细胞RNA测序分析。研究招募了22名年轻人和20名老年人，所有参与者此前均接种过两剂或三剂灭活疫苗，并接受WSK-V102C疫苗加强免疫。通过利用单细胞转录组、B细胞受体和T细胞受体测序，系统解析了各年龄组外周免疫细胞的转录谱、克隆动力学和细胞间通讯模式。该分析使得能够表征疫苗接种后免疫特征的年龄相关差异，包括转录状态、克隆结构和推断的细胞间通讯模式。本研究为理解加强疫苗接种后年龄相关免疫组织提供了描述性框架，并指明了未来机制和纵向研究的方向。
材料与方法
本研究遵循《赫尔辛基宣言》原则进行，获得南京鼓楼医院研究伦理委员会批准。共招募42名健康参与者，包括21名男性和21名女性，分为年轻组和老年组。所有参与者接种单剂WestVac Biopharma的Coviccine?三价XBB疫苗（WSK-V102C），该疫苗包含XBB.1.5、BA.5和Delta SARS-CoV-2变异株的重组受体结合域，并使用角鲨烯水包油乳液作为佐剂。接种前所有参与者均具有实验室确认的SARS-CoV-2感染史。在接种前和接种后28天采集外周血样本，分离PBMCs进行单细胞RNA测序。使用10x Genomics Chromium Single Cell平台构建文库，并在Illumina NovaSeq平台上测序。数据使用Seurat包进行质控和预处理，并通过Harmony包进行批次校正。细胞聚类使用UMAP和基于图的聚类方法。B细胞受体和T细胞受体序列使用Cell Ranger流程分析，定义疫苗相关克隆。细胞间通讯分析使用CellChat框架，转录因子调控分析使用pySCENIC流程。差异表达基因和功能富集分析使用muscat和clusterProfiler包进行。伪时间分析和细胞状态转换使用STARTRAC方法量化。
结果
XBB.1.5加强疫苗接种后中和抗体应答的年龄相关差异
通过假病毒中和试验测量血清对 ancestral D614G 毒株和五种SARS-CoV-2变异株的中和抗体滴度。加强免疫后两组针对所有测试变异株的抗体滴度均显著升高，但年轻个体的抗体增加倍数始终高于老年个体。年轻个体对XBB.1.5的抗体增加倍数最为显著，其次是BA.5、BA.2.87.1、JN.1、D614G和B.1.617.2。尽管绝对中和抗体滴度在年龄组间存在显著重叠，但老年个体增加幅度一致较小，凸显了加强疫苗接种后抗体应答相对强度的年龄相关差异。
年轻和老年队列接种前后外周免疫细胞的动态单细胞转录图谱
对92个PBMC样本进行scRNA-seq分析，共保留882,324个高质量单细胞转录组。无监督聚类鉴定出五种主要免疫细胞群：CD4+T细胞、CD8+T细胞、NK/NKT细胞、B细胞和髓系细胞。各组间这些免疫细胞类型的总体分布一致，未观察到显著组成差异。
老年个体加强免疫后观察到的成熟受损和抗原特异性分化
鉴定出五个B细胞簇：B_Naive、B_Memory_Unswitched、B_Memory_Class_Switched、B_Cycling和Plasmablasts。四组间B细胞总体比例无显著差异。基因集富集分析显示，加强免疫后年轻个体的B_Naive和B_Memory_Class_Switched细胞相较于老年个体显著富集淋巴细胞激活、增殖、分化、炎症应答、适应性免疫应答和细胞因子应答相关基因集。年轻个体还显示V(D)J重组和细胞粘附通路富集，表明特定激活和免疫球蛋白基因组装过程。相比之下，老年个体的B细胞缺乏B细胞信号传导、激活和免疫应答相关通路的显著富集，浆母细胞除外。与年龄匹配未接种健康对照的比较表明，接种前队列B细胞亚群的基线转录状态与未接种个体广泛可比，支持观察到的转录变化主要与XBB.1.5适应性疫苗的接种后应答相关。
细胞间通讯分析显示，年轻个体接种前B细胞簇与调节性T细胞的相互作用最强，接种后显著下降。老年个体的相互作用网络在接种前后相对不变。接种后年轻个体B细胞与Tregs的相互作用减少，而老年个体则相反，表明年轻个体Tregs可能发挥更动态的免疫调节控制，而该调节功能随衰老减弱。
老年个体记忆偏向的B细胞激活和生发中心样成熟受损
BCR序列分析显示接种后两组B细胞克隆均显著扩增。疫苗相关B细胞分析显示年轻个体SARS-CoV-2相关IGHV基因使用频率显著高于老年个体，包括IGHV3-53/3-66、IGHV5-51/4-39和IGHV1-69/3-30/2-5等公共克隆型。相比之下，老年个体的克隆扩增以有限数量的优势克隆为主，最显著的是使用IGHV3-23和IGHV3-74的克隆。体细胞超突变水平在两组接种后疫苗相关B细胞中均显著升高，但老年个体IgM、IgA和IgG B细胞的SHM水平始终高于年轻个体，可能反映长期记忆B细胞的突变累积或WSK-V102C疫苗接种优先重新激活老年个体的记忆B细胞而非诱导年轻个体观察到的幼稚B细胞新发应答。
进一步分析显示老年个体疫苗相关B细胞比例与针对XBB.1.5变异株的中和抗体滴度呈显著正相关，而年轻队列无此相关性。表明年龄组间B细胞应答组织存在差异，老年个体应答由有限数量的扩增克隆主导，而年轻个体抗体应答可能涉及多个B细胞亚群的更复杂贡献。
老年个体CD4+T细胞分化受损伴随Treg介导的抑制增强
单细胞转录组分析鉴定出10个主要T细胞簇。接种后年轻个体的T_CD4+Naive和T_CD4+Tcm细胞相较于老年个体显著富集T细胞激活、分化、炎症应答、MHC II类抗原呈递和细胞因子产生相关基因集。年轻个体的T_CD4+Tem细胞还显示免疫效应功能、蛋白复合物组装和抗原呈递通路富集。老年个体的CD4+T细胞也对疫苗接种产生应答，但强度较低。老年个体Treg介导的免疫抑制特征显著升高，而年轻个体接种后Treg活性降低。与未接种健康对照的比较支持接种后观察到的CD4+T细胞亚群增强转录激活更可能与接种后免疫应答而非预先存在的免疫差异相关。
老年个体CD4+T细胞显示受限的克隆扩增和向效应及辅助亚群分化受损
TCR序列分析显示接种前两组均存在T细胞克隆扩增。接种后两组均检测到疫苗相关T细胞克隆，但老年个体TRAV和TRBV基因使用模式基本不变，表明疫苗接种主要重新激活预先存在的记忆T细胞克隆而非产生新的疫苗特异性库。年轻个体则表现出TCR库的动态重塑，包括COVID-19患者中先前高频率和低频率基因使用一致下降。可能反映XBB特异性TCR库的出现或免疫应答消退期激活T细胞的自然收缩。表明老年个体TCR库相对静态，以记忆回忆应答为主，而年轻个体表现出更灵活和适应性的克隆重塑。
老年个体疫苗诱导的B细胞应答显示克隆特异性降低和记忆B细胞-CD4+T细胞相互作用受损
基因集变异分析显示接种后年轻个体的B_Naive、B_Memory_Unswitched和B_Memory_Class_Switched细胞显著富集适应性免疫应答和急性炎症相关基因集，而老年个体B细胞缺乏此类富集。年龄相关B细胞基因特征显示接种后老年个体ABC富集增加。无监督聚类鉴定出10个B细胞亚簇。克隆扩增分析显示年轻个体浆母细胞中包含显著更高比例的疫苗相关克隆。细胞通讯分析显示年轻个体记忆B细胞与CD4+T细胞具有更多配体-受体对相互作用。
STARTRAC转换指数和伪时间分析显示老年个体B细胞主要从记忆B细胞亚群分化为浆母细胞，而年轻个体遵循两个分化轨迹：一个从c03_Bn亚群出发，通过生发中心样激活途径产生浆母细胞；另一个形成记忆B细胞亚群。转录因子分析显示年轻个体CEBPA、CEBPB、CEBPD、HDX、RXRA和MAFB在除浆母细胞外的B亚群中高表达，JUNB和JUND在接种后浆母细胞中选择性上调。
XBB.1.5三价加强疫苗优先参与c07和c09 CD4+T细胞亚群并呈现年龄分化应答
无监督聚类鉴定出九个CD4+T细胞亚簇。c09亚群接种后疫苗相关CD4+T细胞富集最高。记忆亚群基因表达谱显示c07和c09亚群表达升高的年龄相关T细胞标志物、MHC-II和抗原加工基因。克隆扩增分析显示两组疫苗相关CD4+T细胞克隆分布无显著差异。细胞通讯分析显示c07和c09 Tm亚群与B细胞具有最广泛的配体-受体相互作用。伪时间轨迹分析显示老年个体CD4+T细胞遵循相对线性轨迹，而年轻个体观察到两个分化轨迹，包括一个以TCR相关基因逐渐上调为特征的新分支。转录因子分析显示年轻个体KLF7在CD4+T细胞亚群中广泛上调，KLF6一致下调，MAFB、RXRA、CEBPB和CEBPD在多个B细胞和CD4+T细胞亚群中高表达。
讨论
本研究通过整合单细胞转录组学和免疫组库分析，严格定义了疫苗相关克隆，并解析了针对WSK-V102C（一种XBB.1.5三价重组蛋白疫苗）的加强后免疫应答。通过追踪浆母细胞克隆起源和构建跨年龄组的综合单细胞免疫图谱，鉴定了加强疫苗接种后体液和细胞免疫组织的年龄相关差异。这些发现提供了变异株适应性SARS-CoV-2疫苗接种后免疫协调如何在不同年龄间差异的描述性视图。
在B细胞水平，加强疫苗接种后观察到明显的年龄相关应答模式。老年个体接种后B细胞特征表现为幼稚B细胞亚群激活减少和更依赖记忆偏向分化的转录程序。年轻个体则显示更广泛的B细胞激活、克隆扩增和幼稚B细胞区室参与特征。尽管老年个体疫苗相关B细胞表现出更高体细胞超突变水平，但年轻个体SARS-CoV-2相关IGHV基因使用比例更高，表明年龄组间预先存在的免疫记忆和新发激活对接种后应答的贡献方式存在差异。
值得注意的是，接种后28天的中和抗体滴度与老年个体疫苗相关B细胞克隆扩增程度相关，而与年轻个体无关。这种分歧表明加强疫苗接种后体液免疫应答组织存在年龄相关差异。老年个体体液应答似乎主要由预先存在的记忆B细胞区室的定量回忆和扩增驱动，可能导致克隆扩增与抗体生产之间更直接的相关性。与此解释一致，老年个体的克隆扩增以优先扩增有限数量的优势B细胞克隆为特征。记忆偏向应答和更受限的克隆架构结合可能因此导致该年龄组观察到的抗体滴度与B细胞扩增之间的强线性关系。
相比之下，年轻个体的抗体应答可能来自记忆回忆和幼稚B细胞新发激活的更复杂整合。这种复杂性可能掩盖与B细胞亚群的简单线性关系，同时有助于更高的整体应答质量。与年龄相关生发中心动态改变的报告一致，这些模式可能影响接种后抗体应答的广度和持久性。值得注意的是，单细胞RNA测序未揭示老年个体B细胞总体丰度或亚群多样性的显著减少，表明尽管存在年龄相关重塑，加强疫苗接种可能维持外周B细胞激活。
年龄相关差异在CD4+T细胞应答中也很明显。基线时老年个体CD4+T细胞表现出与先前激活和分化一致的转录特征。加强疫苗接种后，年轻个体显示更显著的与激活、分化、抗原呈递和B细胞应答细胞因子支持相关的接种后程序。尽管两组均观察到克隆扩增，但老年个体TRAV/TRBV基因使用转变有限，与先前报道的老年人抗原特异性T细胞库受限一致。这些发现表明疫苗接种后细胞免疫可塑性和库重塑存在差异。
T细胞受体使用分析进一步显示，基线时SARS-CoV-2相关库中代表性较高的基因在接种后频率下降，尤其在年轻个体中。这种模式表明加强免疫后TCR使用动态重塑，而老年个体TCR库显得更稳定和记忆偏向。尽管年龄相关胸腺萎缩和退化限制T细胞受体多样性可能导致这些差异，但替代解释（如激活T细胞群体在28天前收缩）不能排除。鉴于变异株特异性TCR库数据有限，需要进一步研究验证和扩展这些观察结果。
单细胞伪时间分析进一步支持这些年龄相关模式。老年个体B细胞轨迹显示优先偏向从记忆B细胞亚群向浆母细胞分化，而年轻个体显示分化为浆母细胞和记忆B细胞谱系的双分支轨迹。同时，年轻个体显示B细胞亚群与CD4+T细胞之间更显著的细胞间通讯，与接种后更高程度的协调免疫激活一致。这些观察结果表明，老年个体接种后B细胞应答更受预先存在的记忆区室参与塑造，幼稚B细胞招募相对有限。这种应答模式与通过更聚焦和记忆依赖途径的有效抗体诱导一致，与年轻个体观察到的更广泛和多样化的B细胞激活景观形成对比。
转录因子分析揭示了年龄相关调控程序。年轻个体B细胞和CD4+T细胞中均观察到CEBPB、CEBPB和MAFB等转录因子的协调富集，而老年个体这种一致性较不明显。加强疫苗接种后还观察到KLF7和KLF6的差异表达，表明与细胞因子相关信号通路相关的转录程序存在年龄相关差异。老年人中促炎细胞因子（特别是IL-6）水平降低与有限的T细胞增殖和激活、B细胞向浆细胞分化受损以及抗体产生减少相关。已知KLF6激活负调控NF-κB通路
