《Emerging Microbes & Infections》：Investigating high pathogenicity avian influenza virus incursions to remote islands: Detection of H5N1 on Gough Island in the South Atlantic Ocean
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本文报道了在南大西洋偏远的高夫岛（Gough Island）特里斯坦贼鸥（Tristan skua）中首次检测到高致病性禽流感病毒（HPAIV）H5N1分支2.3.4.4b，结合基因组学与全年追踪数据，揭示了其传播路径更可能源自南乔治亚岛（South Georgia）而非非洲大陆，强调了远洋海鸟在病毒全球扩散中的关键作用及对偏远生态系统构成的严重威胁。
摘要
理解高致病性禽流感病毒（High Pathogenicity Avian Influenza Virus, HPAIV）的出现和传播机制对于追踪其全球传播至关重要，特别是通过迁徙海鸟进行的远距离传播。食腐海鸟，如贼鸥，可能同时作为病毒储存库和传播媒介，并自2021年以来与多次疫情暴发相关联。本文报告了在南大西洋中部高夫岛（Gough Island）的三只特里斯坦贼鸥（Stercorarius antarcticus hamiltoni）尸体中检测到HPAIV H5N1分支2.3.4.4b。为调查潜在的入侵途径，我们结合了基因组分析和来自全球定位传感器（Global Location Sensors, GLS）的全年追踪数据。尽管迁徙模式暗示南部非洲是最明显的传播路径，但在高夫岛检测到的毒株与在南乔治亚岛（South Georgia）鉴定的毒株更为接近，表明感染可能发生在产卵前离巢期（pre-laying exodus），此时贼鸥会扩散到岛屿南部的锋面水域。高夫岛尚未确认更多病例，但需要更系统的监测以了解病毒感染动态。高夫岛贼鸥中HPAIV H5N1的检测凸显了持续警惕、主动且地理覆盖全面的监测策略、全球生物安全措施的重要性，同时需要努力减轻对全球重要海鸟种群的其他压力，以帮助增强其抵抗力。
引言
HPAIV的持续扩散对野生动物、家畜以及通过其人畜共患潜力对人类健康构成重大威胁。自1996年首次在中国家禽中出现以来，A/goose/Guangdong/1/96 (GsGd)谱系的HPAIV H5Nx已进化出在全球多种鸟类中有效传播的能力，导致前所未有的大规模死亡事件。通过迁徙物种传播至欧洲后，H5N1经由东大西洋迁徙路线到达北美，并于2022年10月前迅速蔓延至整个南美洲，对海鸟和鳍足类动物种群造成毁灭性影响。2023年南半球春季，HPAIV抵达亚南极岛屿和南极洲，首次在南乔治亚岛的鸟岛（Bird Island）的棕贼鸥（Stercorarius antarcticus）中检测到。随后，病例报告出现在福克兰群岛（Falkland Islands）的南部 fulmar（Fulmarus glacialoides）和黑眉信天翁（Thalassarche melanophris）以及南极半岛的多个物种中。遗传分析表明，这些地区的检测与源自南美洲的毒株相关，可能通过贼鸥、鸥鸟和大海燕（giant petrels）等食腐海鸟的长距离移动引入。在接下来的2023/2024繁殖季，病毒进一步向东扩散至亚南极地区并进入南印度洋，导致马里恩岛（Marion Island）的漂泊信天翁（Diomedea exulans）雏鸟大量死亡，随后在克罗泽群岛（Crozet）和凯尔盖朗群岛（Kerguelen）也有报道，这些地方的大规模死亡事件主要影响南象海豹（Mirounga leonina）。遗传证据表明，克罗泽和凯尔盖朗的疫情暴发源于与南乔治亚岛相关的独立引入事件，而非来自更近的南部非洲海岸。
位于南大西洋中部的高夫岛，距离南乔治亚岛东北约3,600公里，距离马里恩岛西北约2,450公里，被认为是全球最重要的海鸟繁殖地之一。尽管面积小（约65平方公里），该岛支撑着估计约800万只、至少24种海鸟的生存，其中许多是该岛或特里斯坦-达库尼亚群岛（Tristan da Cunha）的特有或近特有种，并且若干物种具有全球保护关注度，包括极危（Critically Endangered）的特里斯坦信天翁（Diomedea dabbenena）、MacGillivray's prion（Pachyptila macgillivrayi）和高夫岛雀（Rowettia goughensis）。因此，HPAIV传入这一敏感环境的可能性一直是一个重要的保护关切。2022年的一项风险评估认为HPAIV在高夫岛出现的可能性“低”。然而，HPAIV动物疫情传入南半球及其在亚南极地区的持续扩张已显著增加了入侵风险。南部非洲沿海地区也报告了反复的HPAIV疫情，病毒经由亚欧-非洲迁徙路线从欧洲传播而来。因此，高夫岛在南大西洋沿主要迁徙路线和海洋走廊的独特地理位置，连接大西洋和南大洋，使其容易受到来自多个方向的HPAIV引入。
高夫岛繁殖海鸟种群中的禽流感病毒（Avian Influenza Virus, AIV）抗体首次于2009年检测到，当时一项血清学调查揭示了特里斯坦贼鸥（S. a. hamiltoni；下文简称特里斯坦贼鸥）和北跳岩企鹅（Eudyptes moseleyi）的暴露史，表明AIVs此前曾到达该岛并在这些物种中传播。特里斯坦贼鸥是特里斯坦-达库尼亚群岛的特有种，其大部分种群在高夫岛繁殖。鉴于其食腐行为，贼鸥既是疾病传播的关键储存库也是媒介，因此研究其移动对于识别引入途径至关重要。
本文描述了2024年9月在高夫岛三只特里斯坦贼鸥中检测到HPAIV H5N1分支2.3.4.4b，并利用病毒遗传分析和全年GLS追踪数据相结合的方法调查了潜在的入侵路线。
材料与方法
研究地点
高夫岛（40°19′12″S, 09°56′24″W）是英国海外领土圣赫勒拿、阿森松和特里斯坦-达库尼亚的一部分，位于南大西洋中部。高夫岛距离特里斯坦-达库尼亚群岛（包括特里斯坦-达库尼亚岛、 inaccessible岛、 Nightingale岛及其小岛）约380公里东南偏南。高夫岛无人居住，仅有一个7-9人的小型常年研究站团队。研究站每年9月/10月由南非研究船SA Agulhas II号补给一次。一个2-3名生物学家的野外团队常年驻岛，作为长期监测和科学计划的一部分，接受过培训以监测不寻常的鸟类死亡事件。
追踪数据
2017年10月至11月，在高夫岛研究站附近对10只正在孵卵的成年特里斯坦贼鸥部署了Migrate Technology Intigeo–C330地理定位标签（GLS）。标签附着在标准的不锈钢SAFRING环上。在接下来的繁殖季收回了八个标签；另外两个设备未回收。
光强度数据在R版本4.4.1中使用SGAT包（v0.1.3）处理，采用贝叶斯状态空间模型基于黄昏过渡时间估计可能位置，同时考虑光检测和移动行为的不确定性。原始光数据使用BAStag包（v0.1.3）进行预处理，以根据光强度阈值识别黄昏事件（日出和日落）。这些黄昏时间随后经过手动审查和编辑，以校正由遮蔽、云层覆盖或行为因素（如孵卵）引起的异常。所得数据用于推断每天两个位置，对应于每日的黄昏过渡。
为量化空间利用，我们使用adehabitatHR包（v0.4.22）计算了核利用分布（Kernel Utilisation Distributions, KUDs）。SGAT导出的位置估计被投影到等面积坐标参考系上，以便进行无偏空间分析。对每只鸟，计算了50%和95%的KUD，分别代表产卵前期、繁殖期和非繁殖期的核心利用区域和家域范围。2017年和2018年孵卵期间的位置数据合并用于KUD分析。为评估种群水平空间利用，对个体KUD进行平均以评估空间栖息地利用。繁殖地和非繁殖地之间的迁徙路径被排除在KUD分析之外，而是使用原始位置数据进行可视化。对于每个个体，离开繁殖地向东北迁徙的开始点定义为个体与群落距离持续增加且后续无减少的点；向西南返回迁徙的开始点定义为距离持续减少且后续无增加的点。每个迁徙阶段的结束点定义为与群落距离稳定、表明到达新居住区的点。所有空间操作均使用R中的sp、sf和raster包进行。
尽管我们承认本研究使用的GLS数据是在HPAI检测前最多六年收集的，但我们预计该种群的移动模式基本保持一致。迁徙海鸟，特别是当越冬地与可预测环境（如上升流系统）相关时，对特定越冬地的长期（多年）忠诚度很常见，重复利用可增加对当地资源和猎物动态的熟悉度。尽管气候变化可能逐渐改变海洋环境的可预测性，但特里斯坦贼鸥使用的越冬地在近十年间（2009/10, 2010/11, 2011/12, 2017/18）多个繁殖季的持续存在表明这种忠诚度继续赋予生态益处，因此可能代表了当今更广泛的高夫岛贼鸥种群。
样本采集
从死鸟的脑、气管和泄殖腔采集拭子样本，采集后一小时内于-20°C冷冻，并运往世界动物卫生组织/联合国粮农组织（WOAH/FAO）禽流感国际参考实验室（位于英国韦布里奇的动物和植物卫生署，APHA）进行诊断评估。对可疑野生动物死亡事件的监测持续进行，特别关注任何空间或时间上的病例聚集或野生动物异常行为。
分子方法
从所有拭子样本中提取总核酸，并使用四种实时逆转录聚合酶链反应（rRT-PCR）检测方法进行病毒RNA筛查，包括：i) 用于通用甲型流感病毒检测的基质蛋白（M）基因检测；ii) 用于HA亚型和致病型分型的HPAIV H5分支2.3.4.4b特异性检测；iii) 用于确认神经氨酸酶类型的N1亚型特异性rRT-PCR；iv) 禽副粘病毒1型（APMV-1）大聚合酶（L）基因检测。所有rRT-PCR均在Agilent AriaMx qPCR系统上进行。阳性脑组织拭子样本材料用于在10日龄无特定病原体（SPF）鸡胚中进行病毒分离，依据国际认可方法。
病毒测序
对脑组织拭子进行全基因组测序（Whole-Genome Sequencing, WGS）。提取的vRNA转换为双链cDNA，并使用SuperScript III一步法RT-PCR试剂盒（Thermo Fisher Scientific）进行扩增。PCR产物经Agencourt AMPure XP磁珠（Beckman Coulter）纯化后，使用Native Barcoding Kit（Oxford Nanopore Technologies）进行测序文库制备，并按照制造商说明在GridION Mk1（Oxford Nanopore Technologies）上进行测序。甲型流感病毒基因组的组装使用定制的内部流程完成。
系统发育分析
为确定高夫岛病毒与其他报告毒株的遗传亲缘关系，收集了EpiFlu数据库中2020年1月1日至2025年7月28日期间的HPAIV H5N1分支2.3.4.4b序列。为去除过度代表的组，使用PARNAS将序列子集化以覆盖0.5%的序列差异。剩余数据集按片段分开，使用Mafft v7.525进行比对，并使用Aliview v.2021手动修剪至开放阅读框。修剪后的比对用于使用IQ-Tree v2.4.0推断最大似然（Maximum-Likelihood, ML）系统发育树，使用模型查找器、1000次超快速自举法和SH-like近似似然比检验。使用GenoFLU-multi确认高夫岛序列的分支分类。
为生成时间尺度系统发育树，使用了所有来自南美洲和南极洲的H5 HA序列，以及北美序列的子集以改善时间信号。数据集经过比对、修剪，并使用上述相同方法推断ML系统发育树。然后使用TreeTime v0.11.4基于HA ML系统发育树推断时间尺度系统发育树。使用TreeTime中的mugration推断模型进行位置间转换的离散性状分析，采用默认设置。
结果
2024年9月12日，在高夫岛研究站附近直升机停机坪的一个由50-200只非繁殖贼鸥组成的集群中，首次观察到一例疑似HPAIV相关的成年特里斯坦贼鸥死亡。次日，同一地点另一只贼鸥表现出与HPAIV一致的临床症状，包括头部和翅膀下垂、嗜睡、无法行走或飞行，并于同一天晚些时候被发现死亡。9月15日发现另外两具尸体。于2024年9月20日从四具尸体中的三具采集了拭子样本，随后将尸体掩埋。第四具尸体在采样时已消失，推测被其他贼鸥啃食。
样本的诊断评估
高夫岛采样的三只鸟的口咽和脑拭子均检测出HPAIV H5N1阳性，但泄殖腔拭子检测为阴性。脑样本显示高病毒载量，H5 rRT-PCR Ct值在19.5至23.8之间。尝试对三个脑样本中的两个进行病毒分离，两者均产生血凝病毒。
从两个样本获得的全基因组序列确认病毒属于HA分支2.3.4.4b，基因型B3.2，与先前在南极地区检测到的病毒一致。两个WGS在所有基因上的共享度超过99%。系统发育分析显示，这些病毒是南极半岛和亚南极地区内一个单系群的一部分，包括来自南乔治亚岛的祖先病毒及其在克罗泽群岛和凯尔盖朗群岛的后代，这与Banyard等人描述的引入途径的扩展一致，而非来自非洲的新入侵。不对称转换率矩阵的分析揭示了关键亚南极和南大西洋岛屿之间病毒移动的显著模式。南乔治亚岛似乎是一个重要的祖先来源地，表现出向克罗泽、凯尔盖朗、高夫岛和福克兰群岛的外向转换。高夫岛显示出跨区域的适度连通性，特别是与克罗泽和凯尔盖朗。然而，从高夫岛到南乔治亚岛及返回的转换率表明双向交换不太频繁。总体而言，数据支持一个模型，即南乔治亚岛作为主要来源地，在整个亚南极和南大西洋岛屿中传播病毒。
环志与追踪数据
追踪持续时间从343天到353天不等（平均值±标准差：345 ± 3.3天），每个个体产生687 ± 7.8个位置。核利用分布揭示了特里斯坦贼鸥空间利用的明显季节性变化。在产卵前离巢期，鸟类将其觅食活动集中在亚南极锋面周围水域，平均95%利用分布（家域）为977,900平方公里，相应的50%核心区域为151,100平方公里。在繁殖期间，空间利用变得更加局限于高夫岛周围，平均95% UD减少至567,000平方公里，50%核心区域为128,900平方公里，与中心地点觅食的限制一致。相比之下，非繁殖期的特点是活动区域显著扩张和位移至南非和纳米比亚大陆架，贼鸥在此占据平均95% UD为1,711,300平方公里，50%核心区域为394,400平方公里。在这些时期，核心区域始终代表更广泛家域中一个较小的、高利用度的子集，而迁徙走廊被排除在KUD估计之外，并作为移动轨迹单独呈现。
繁殖季结束后，个体在2018年1月12日至2月12日期间离开高夫岛周围的觅食地，前往南非和纳米比亚海岸外的非繁殖觅食地。到达这些非繁殖区域的时间在2018年1月20日至2月25日之间，向东北迁徙耗时11.9 ± 4.9天（范围4-17天）。个体在非繁殖越冬地停留141 ± 19.5天（范围109-165天）。离开这些区域的时间在2018年6月4日至7月15日之间，返回高夫岛附近产卵前觅食地的时间在2018年6月13日至8月1日之间。向西南返回迁徙耗时13.8 ± 6.1天（范围7-23天）。
三只死于HPAIV并采样的贼鸥中有两曾在2016年和2017年于高夫岛环志。2017年环志的个体（SAFRING 888666）是岛上已知的繁殖者，并作为追踪研究的一部分配备了GLS设备（BH142）。相比之下，2016年环志的贼鸥（SAFRING 888054）是在直升机停机坪附近的贼鸥俱乐部作为非繁殖者被捕获的。
讨论
HPAIV H5N1抵达高夫岛代表了迄今为止地理上最偏远的检测之一，凸显了远洋海鸟种群的相互关联性及其在协助当前HPAIV H5N1动物疫情全球传播进入一些世界上最偏远（和敏感）生态系统中的作用。高夫岛特里斯坦贼鸥中HPAIV的确认引发怀疑，认为个体可能感染了源自非洲的病毒，因为该物种在非繁殖季与南部非洲沿海栖息地存在广泛联系。本研究分析的GLS数据证实了这种迁徙模式，表明该物种利用本格拉上升流系统作为越冬觅食地具有高度的时空一致性。南部非洲海鸟群落中多次爆发的HPAIV H5分支2.3.4.4b疫情可能为传播给贼鸥等食腐物种提供了机会。然而，对全球H5 HA分支2.3.4.4b序列的系统发育分析将高夫岛病毒置于南美洲毒株的一个簇内，与在非洲检测到的病毒株不同，并且与在南乔治亚岛发现的毒株密切相关。考虑到疫情暴发与物种内和跨物种季节性及迁徙移动的时间背景，也支持了经由南美洲和亚南极的传播途径的扩展。根据2018年的追踪记录，特里斯坦贼鸥在1至3周内完成向西南迁徙返回繁殖地，在6月中旬至8月初抵达高夫岛附近。虽然HPAIV的潜伏期因物种易感性和病毒遗传特征而异，但考虑到高夫岛首次观察到HPAIV是在9月中旬，症状仅在感染后2-4个月出现（假设2024年迁徙时间大致相似）的可能性不大。因此，基于系统发育分析和疫情暴发时间，病毒更可能通过南大洋或大西洋迁徙路线抵达高夫岛，可能是在该物种8月和9月的产卵前离巢期，此时特里斯坦贼鸥扩散到岛屿南部的锋面区域。
虽然陆地聚集地（如繁殖地）是病毒传播的明显热点区域，但海上连通性在向高夫岛等偏远地点传播中可能扮演同样关键的角色。重叠的觅食地和共享的海洋栖息地增加了地理上遥远种群之间种间接触的潜力和促进病毒传播的可能性。尽管目前尚无HPAIV在海上传播的已知报告，但与其他海鸟物种相比，食腐物种更可能与尸体互动、在水面上停留更长时间以及与其他觅食个体密切接触。此类行为增加了病毒传播的机会，而在环境中病毒粒子被稀释的情况下，感染本来很可能被阻止，从而支持了贼鸥和大海燕作为AIV跨越南大洋最可能媒介的作用。
营养丰富的亚热带和南极极锋之间的边界水域已知支撑着大量远洋海鸟的聚集，并是海洋哺乳动物的重要觅食地。在这些共享的觅食地上高频度和可能性的种间相互作用，无论是直接还是间接接触，都使此类区域成为传染病持续存在和传播的高风险区域。在高夫岛繁殖的海鸟物种同时利用南大洋和大西洋迁徙路线，这些路线在30-60°S之间重叠显著，将南极海鸟种群与南大西洋岛屿上的种群连接起来。此外，已发现南乔治亚岛繁殖的种群利用高夫岛附近水域，包括南象海豹、棕贼鸥和黑眉信天翁。然而，最终，本研究中HPAIV传播给特里斯坦贼鸥的时间和地点仍然未知，关于贼鸥是将病毒引入岛屿还是
