《Nutritional Neuroscience》：Probiotics and developmental progression in healthy preschool-aged children: a double-blind, placebo-controlled trial
引言背景
肠道与大脑通过肠-脑轴存在双向通信机制，胃肠道通过2亿–6亿个神经元与大脑相连。这种通信通过多种生物机制实现，包括γ-氨基丁酸（GABA）等神经递质的产生和短链脂肪酸合成，这些物质对神经发育和行为具有调控作用。微生物组-肠道-脑轴包含内分泌-免疫系统、中枢神经系统（CNS）、自主神经系统、下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴和肠道微生物群等关键组成部分。
在人类研究中，焦虑、抑郁和自闭症谱系障碍（ASD）患者的肠道微生物群组成变化为肠-脑轴的存在提供了证据。例如，Kumperscak等人研究了益生菌LGG（ATCC53103）对4–17岁儿童青少年注意缺陷多动障碍（ADHD）症状、健康相关生活质量（QoL）和血清细胞因子水平的潜在影响，发现益生菌干预三个月后PedsQL儿童自评总分显著改善（p=0.021，d=0.53）。Lin等人的系统评价对涉及早产儿的九项试验进行分析，发现当益生菌给药时间超过六个月时，神经认知结局显著增强。
Kim等人开展了一项随机对照多中心试验，评估益生菌对社区居住老年人认知和情绪的影响。该研究招募了63名健康老年人（≥65岁），使用Bifidobacterium bifidum BGN4和Bifidobacterium longum BORI益生菌进行为期12周的干预。虽然研究对象为老年人群，但由于其纳入“健康”个体并发现益生菌对认知和情绪有积极影响，支持了肠-脑轴连接，因此对当前研究具有重要意义。干预组在心理灵活性测试和压力评分方面比对照组表现出更大改善（p<0.05），表明益生菌可以刺激健康老年人的心理灵活性并缓解压力，同时改变肠道微生物群的组成。
然而，益生菌对健康儿童心理发育的影响尚未探索。鉴于肠道细菌与大脑功能之间的重要关系，推测使用益生菌可能增强健康儿童的认知功能，从而帮助其实现当前和未来的最佳认知潜力。某些乳酸杆菌（Lactobacillus）和双歧杆菌（Bifidobacterium）物种能够产生GABA（中枢神经系统的抑制性神经递质），可调节情绪、记忆和其他认知功能。
因此，结合Kumperscak和Kim研究报告的临床益处，测试含有不同乳酸杆菌和双歧杆菌菌株的多菌株益生菌是合理的。这是由于它们具有互补机制，如神经递质产生、免疫调节和支持肠道屏障完整性，可能共同改善神经发育结局。
本研究预期对健康儿童的积极影响将不同于在老年人中观察到的情况，因为儿童仍处于生命发育阶段。因此，预计儿童将在与发育里程碑相关的认知功能方面表现出改善，包括沟通、社会沟通、精细和大运动技能、个人-社会行为、问题解决、顺从性、自我调节、适应功能和自主性。故本研究旨在探讨益生菌补充对健康儿童发育进程的影响。
材料与方法
本研究采用前瞻性、随机、双盲、安慰剂对照设计，包括为期6个月（每月定义为28天）的多菌株益生菌/安慰剂补充。该研究是一项更大规模随机对照试验的一部分，该试验还评估了益生菌对常见感染发生率的影响。
主要结局是评估益生菌补充对儿童发育表现的影响，包括但不限于沟通、大运动技能、精细运动技能、问题解决、自我调节、自主性和社会情感技能。次要结局包括评估益生菌对体重、身高、父母报告的发育结局、食欲、睡眠和消化的影响，以及识别其他影响发育的因素。
干预措施为Biome Daily Kids?益生菌（TGA批准号：317898），与不含活菌的安慰剂进行比较。使用计算机生成程序（SPSS，28.0版）随机分配至安慰剂组或益生菌组。但在兄弟姐妹入组的情况下，他们被分配到同一研究组，以防止在家中混合安慰剂和益生菌产品。益生菌和安慰剂包装相同，直接参与研究的人员均不知晓产品的真实性质。每袋（每日剂量）益生菌包含以下菌株，总剂量为100亿活性荧光单位（AFU）：植物乳杆菌6595（ATCC 53103）30亿AFU、鼠李糖乳杆菌GG（ATCC 53103）20亿AFU、动物双歧杆菌乳亚种BS01（LMG P-21384）20亿AFU、干酪乳杆菌LC03（DSM 27537）10亿AFU、短双歧杆菌BR03（DSM 16604）20亿AFU。选择100亿AFU的剂量被认为是充足且安全的，因为先前在类似队列中使用了相似剂量。
研究样本为维多利亚州（澳大利亚）早期儿童教育机构（ECES）（包括 childcare 和 kindergarten）注册的2–5岁儿童。选择该特定人群是基于总体研究的主要目的，即评估益生菌对ECES中儿童常见感染发生率的影响。纳入标准主要为年龄≥2岁且每周至少参加ECES两天的儿童。排除标准包括年龄>6岁的儿童、入组时正在接受益生菌和/或益生元产品的儿童、不愿意或无法在研究期间停止所有其他益生菌和/或益生元来源的父母。此外，如果儿童正在服用可能与益生菌补充剂相互作用、影响免疫系统或影响认知功能的药物，或患有严重慢性疾病或心理问题，则被排除。
样本量计算基于父研究（调查益生菌对常见感染发生率的影响）的要求。由于这是首次此类研究，没有先前研究可作为参考来估计益生菌补充对发育领域的潜在影响。106名参与者的样本量被认为适合该研究，两组平均分配。该计算基于先前研究报告的益生菌对感染的影响，并纳入了20%的预期差异、80%的检验效能和0.05的alpha水平。考虑到估计15%的脱落率，目标总样本量为120名参与者。招募完成后，使用计算机软件（SPSS，28.0版）将参与者随机分配到两组之一。
儿童发育评估使用年龄与发育进程问卷第3版（ASQ-3）和年龄与发育进程社会情感问卷第2版（ASQ:SE-2）。补充前数据收集于2022年11月至2023年2月进行，期间收集了发育评估和其他基线测量，包括全面的人口统计信息和家庭动态。此外，记录了儿童过去和当前的健康状况。对于ASQ-3和ASQ:SE-2的管理，向父母提供了评估程序的详细信息，研究人员提供图片提示和个性化协助以支持儿童的发育评估。补充后发育评估于2023年9月和10月使用年龄调整的ASQ-3和ASQ:SE-2问卷进行。
发育评估工具ASQ-3和ASQ:SE-2评估了六个发育领域：沟通、大运动和精细运动技能、问题解决、个人-社会发育和社会情感发育。两种工具都提供了针对特定年龄组的问卷系列。ASQ-3每个领域（沟通、大运动和精细运动技能、问题解决、个人-社会发育）包含六个问题，每个项目按0、5或10分评分，每个领域最高总分60分。分数越高表明发育越好。相反，ASQ:SE-2仅评估社会情感领域，包含约25个问题，也按0、5或10分评分；然而，该工具分数越高表明社会情感发育越低。ASQ-3和ASQ:SE-2都是全球公认的具有强大信度和效度的成熟工具。ASQ-3的信度和效度分别为α=0.92和86%，而ASQ:SE-2的信度和效度分别为α=0.82和84%。同样，另一个常规使用的发育评估工具贝利婴幼儿发育量表被认为不合适，因为它不是为父母管理而设计的，而这是当前研究由于资源限制所要求的。
同样，在基线（单时间点）使用简短的父母完成的食物频率问卷获取了儿童跨主要食物类别的日常摄入量信息。研究中纳入了澳大利亚膳食指南以收集关于份量大小的信息。向父母提供了广泛的示例来说明份量大小和营养素类型，并要求他们报告孩子消耗的份数。
使用SPSS（28.0版）进行数据分析，并采用符合方案集方法，仅包括完成研究治疗和前后发育问卷的参与者。描述性统计用于总结两组的特征，如性别、年龄、体重、家庭收入等，并附带p值（分类变量采用z检验）。ASQ-3和ASQ:SE-2问卷按照年龄与发育进程问卷指南进行分析。报告具有近似正态分布的发育领域的均值和标准差（SD）。使用独立样本t检验分析变量（和组）之间的差异，而使用配对样本t检验评估前后发育。呈现分布严重偏斜的领域时使用中位数，并使用非参数等效检验进行分析。所有统计检验的显著性水平设定为p≤0.05。同样，在基线进行了年龄分段分析，截断值设定为44个月，以捕捉通常在此年龄左右观察到的增强的发育里程碑成就，并确保可比较的组大小以进行充分比较。此外，考虑了正式的整群分析，但由于兄弟姐妹对数量非常少（n=6），会产生不稳定的方差估计，因此在统计上不切实际。
研究获得了联邦大学人类研究伦理委员会的伦理批准（批准号：A21-163）。还获得了维多利亚州教育部的批准（批准号：2022_004555），并在澳大利亚新西兰临床试验注册中心前瞻性注册（编号：ACTRN12622000153718）。所有父母或监护人在研究程序开始前均以通俗易懂的语言获得了关于研究的详细信息，并获得了知情同意。此外，在补充期开始前向父母提供了关于管理补充剂的详细说明。研究遵循赫尔辛基宣言的原则进行。
结果
基线时共有113名儿童纳入本研究。然而，105名儿童完成了试验，益生菌组51名，安慰剂组54名。两组儿童的特征无显著差异。安慰剂组儿童的平均年龄略高于益生菌组儿童。两组中女性儿童相对多于男性儿童。许多儿童来自双亲家庭和英语家庭。同样，许多母亲拥有研究生学位或更高学历。然而，两组中父亲拥有相同（母亲）教育水平的比例相对较小。两组中大多数家庭每周收入超过1900澳元。比较两组儿童基线发育评估（ASQ-3和ASQ:SE-2领域）显示无显著差异，除了ASQ:SE-2评估，安慰剂组儿童表现出更好的结局。
在饮食摄入方面，与推荐膳食指南相比，图示说明了两组儿童消耗的主要食物类别的平均每日份量。虽然两组乳制品（2.1份/天）和蛋白质（1.4份/天）摄入量相似，但安慰剂组儿童消耗的水果（2.6 vs 2.2份/天）和蔬菜（1.9 vs 1.6份/天）多于益生菌组。两组消耗的蔬菜和谷物均少于推荐量。
基线年龄分段分析突出了44个月及以下儿童与44个月以上儿童在平均分数上的显著差异。年龄较大的队列表现出更优的发育结局，特别是在精细运动技能、问题解决和个人-社会领域，这些领域的平均分数对年龄较大组显著更高，正如年龄组之间所预期的那样。具体而言，精细运动技能显示出最显著的差异，超过20%，44个月以下儿童的平均分数为38.73（SD: 13.32），而44个月以上儿童记录为47.50（SD: 14.15; p=0.002）。
这种差异在益生菌和安慰剂干预的前后分析中至关重要，因为后分析发生在前分析六个月后。儿童年龄的增长可能促进了观察到的发育领域的改善。然而，比较安慰剂组和益生菌组将有助于减轻这种潜在的混杂因素。
详细概述了安慰剂组和益生菌组内发育领域的进展。安慰剂组在三个领域显示出显著进展：大运动、问题解决和个人-社会领域。相反，益生菌组在精细运动、问题解决和个人-社会领域表现出显著改善。组间运动技能改善的差异可能代表统计噪声，因为两组在精细和大运动技能方面都显示出改善，但仅在每个组的一个领域观察到统计学显著性。这可能是由于改善略大（临床意义无关紧要）、标准差更窄或两者兼而有之。同样，关于组间改善的差异，在任何领域均未发现显著差异。在身体发育方面，两组儿童的体重和身高均显著增加。然而，关于组间改善的差异，未发现显著差异。同样，观察到的非常小的效应（Cohen’s d=0.008 – 0.087）的事后检验效能较低（2.7% – 6.4%），使用最终样本量（n=105, α=0.05）的敏感性检查表明，该研究本可以达到约80%的检验效能来检测中等效应（d=0.5）。
研究结束时收集的父母报告结局显示，两组在Likert量表评分上没有显著差异。然而，在所有领域，益生菌组的父母提供了略高的评分。
讨论
这是已知的首项评估多菌株益生菌补充对健康（无心理发育问题）儿童发育里程碑影响的研究。该研究未能证明益生菌补充对儿童身体和心理生长有任何直接的、结论性的影响。对此结果有两种可能的解释。首先，益生菌可能确实对该特定队列的发育没有积极影响。其次，任何潜在的积极影响可能是 modest 的，并被其他混杂因素的更强影响所掩盖。下面详细讨论这两种情况。
益生菌确实无效的可能性可能在于其微生物代谢输出而非单纯的细菌定植。益生菌主要通过产生短链脂肪酸（如丁酸盐、丙酸盐和乙酸盐）来调节肠-脑轴，这些脂肪酸在神经发育中起关键作用。例如，丁酸盐已被证明可促进脑源性神经营养因子（BDNF）表达并支持髓鞘形成和认知功能。本研究中使用的益生菌配方可能产生了不足量的短链脂肪酸，或者需要更长的补充时间才能引发可测量的全身或神经认知效应。同样，不能排除益生菌无效的可能性，部分原因是研究队列的特征。纳入研究的儿童不仅来自发达国家，而且他们参加了早期儿童教育机构，这些机构已知对儿童发育有积极影响。
大多数儿童来自双亲、英语家庭，父母拥有研究生学位或更高学历——这是与充分发育相关的重要因素。此外，大多数家庭每周收入为1900澳元或以上，高于全国中位数。而且，两组儿童的饮食摄入量是充足的，因为两组儿童消耗的水果、蛋白质（大约满足）和乳制品达到或高于推荐指南。Guzek等人的系统评价结果支持这些推论，并强调了充足水果摄入对心理健康状况的保护作用。因此，可以推断该队列不仅包括没有身体或心理问题的儿童，还包括来自支持性社会背景的儿童。故两组儿童可能已经达到了其最佳发育里程碑，使得益生菌补充几乎没有显示出任何额外效果的空间。同样，试验中使用的100亿AFU剂量可能不足以调节认知结局。
然而，本研究也揭示了一系列可能掩盖益生菌补充积极影响（如果有）的混杂因素。
最显著的混杂因素是儿童因年龄增长而发生的自然生长和发育，这是预期之中的。假设通过纳入对照组可以控制年龄的影响。然而，结果表明5岁以下儿童发育速度如此之快，以至于益生菌补充的影响可能被与年龄相关的一般生长所掩盖。这在基线年龄分段分析中清晰说明，44个月以上的儿童在评估的6个发育领域中的3个领域表现出显著更高的分数，包括ASQ-3的精细运动、问题解决和个人-社会领域。这一发现进一步得到安慰剂组儿童年龄略大及其因此在基线时更高的发育结局的支持（尽管组间差异无统计学意义）。此外，这些结果与充分记录的儿童在4岁左右达到的发育里程碑一致，包括增强的问题解决能力。在这个年龄，儿童在推理、记忆和决策方面也显示出相当大的进步，即使与年龄较大的儿童相比也是如此。
同样，可以认为针对年龄较大儿童（44个月以上）的年龄调整ASQ-3问卷不够详细或敏感，无法捕捉发育差异。支持益生菌组研究结果的另一个方面是父母报告的结局。尽管益生菌组和安慰剂组之间没有显著差异，但益生菌组所有发育领域的Likert量表结局均高于安慰剂组。
关于ASQ:SE-2，在基线分数中观察到一个值得注意的差异，该评估基于更广泛的评估，包含超过20个问题。与益生菌组相比，安慰剂组儿童在基线时表现出显著更好的ASQ:SE-2分数（46.80 vs. 59.50, p=0.03）。虽然随机化旨在平衡基线特征，但这些差异仍可能偶然发生，特别是在中等样本量的试验中，并且可能反映I类错误。重要的是，这种差异与年龄无关，因为按年龄的基线分析未显示年龄较大儿童的ASQ:SE-2分数有所改善。同样，补充后结果显示两组的ASQ:SE-2分数均无改善。因此，可以更有信心地得出结论，益生菌补充不影响ASQ:SE-2（社会情感）发育结局。因此，尽管存在基线不平衡，但两组整体缺乏变化支持益生菌补充不影响ASQ:SE-2结局的结论。
根据儿童的现有特征，推测安慰剂组相对较高的水果和蔬菜摄入量可能导致了该组更好的ASQ:SE-2结局。Choi等人的研究支持这一点，他们发现学龄前儿童随着水果和蔬菜摄入量的增加，焦虑、抑郁和攻击性行为有所改善。此外，另一项研究表明低蔬菜摄入量与增加的攻击性、焦虑和自我中心有关。
局限性
研究承认几个局限性。首先，饮食和发育评估由父母进行，这可能导致结局的高估或低估。此外，评估仅在补充6个月后进行，这对于益生菌补充显示任何实质性影响可能时间太短。而且，可能并非所有益生菌产品都被完全消耗，或者一些在与食物混合过程中损失，这可能影响了研究结果。研究还承认未进行微生物组分析以确认定植（由于成本限制、后勤复杂性以及与幼儿粪便采样相关的负担）以及未测量的混杂因素（包括体育活动和睡眠）的潜在影响的局限性。同样，研究并未专门为检测发育结局中非常小的差异而设计（敏感性分析表明，该研究本可以达到约80%的检验效能来检测中等效应–d=0.5）；因此，无效发现的缺失应谨慎解释。研究还承认与将兄弟姐妹分配到同一组相关的随机化局限性。约12%的儿童有兄弟姐妹参与研究，这可能对随机化过程引入了微小影响。尽管包含了少量兄弟姐妹对，但通过排除每个家庭中的一个兄弟姐妹进行的敏感性分析显示观察到的结局没有明显差异。
研究意义
建议未来研究需要进行一项大规模对照试验，纳入来自不同社会经济背景的儿童。年龄被确定为一个重要的混杂因素，因此建议未来研究在更窄的年龄带内招募参与者。同样，建议未来的试验包括由专业人员进行的发育评估，并纳入长期补充以及在多个时间点（包括补充停止后）进行发育评估。最后，建议对参与试验的儿童进行微生物组分析，以将肠道微生物群的变化与发育变化（如果发生）相关联。
结论
这是已知的首项探讨益生菌补充对健康儿童发育影响的研究。虽然未观察到显著效应，但研究结果在一个益生菌在早期发育中的使用常被假定为有益而缺乏充分实证验证的领域提供了新颖证据。重要的是，该研究检验效能不足，无法检测细微的神经发育变化。年龄和水果蔬菜摄入量成为发育结局的关键相关因素，强化了饮食和背景在塑造神经认知生长中的影响。因此，未来研究应采用更大、检验效能充足且更多样化的队列，整合微生物组分析，并延长干预持续时间，以更全面地阐明益生菌在儿童早期发育中的作用。
