《Virulence》：Identification of fidelity-determined residues of Porcine reproductive and respiratory syndrome virus through structural alignment
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本研究通过AlphaFold2预测猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）RNA依赖的RNA聚合酶（RdRP）结构，并与柯萨奇病毒B3（CVB3）RdRP进行结构比对，鉴定出调控复制保真度的关键残基。研究发现nsp9-K541R突变通过增强病毒对核糖核苷类似物（如利巴韦林、5-FU、5-AZC）的抗性及降低非连续连接频率，显著提高复制保真度；而A394G、L396S、R401A等突变则降低保真度并促进重组。研究揭示了RdRP结构保守性在RNA病毒保真度调控中的普遍意义，为减毒疫苗的基因组稳定性优化提供了新策略。
摘要
猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）是正链RNA病毒，其非结构蛋白9（nsp9）中的RNA依赖的RNA聚合酶（RdRP）结构域因缺乏外切酶校正功能，在维持复制准确性中起关键作用。为鉴定PRRSV调控复制保真度的残基，研究通过AlphaFold2预测其RdRP结构，并与已解析的CVB3 RdRP结构进行比对，发现PRRSV RdRP中潜在参与保真度调控的保守残基。通过位点定向突变、核糖核苷类似物敏感性试验和二代测序（NGS）分析，发现nsp9 K541R突变可增强保真度，表现为对利巴韦林、5-氟尿嘧啶（5-FU）和5-氮杂胞苷（5-AZC）的抗性提升，以及非连续连接频率降低；而A394G、L396S、R401A等突变则降低保真度，增加重组和突变积累频率。结构建模显示高度保守的K336与关键保真位点K541空间相邻但位于RNA通道相反侧，K336R突变表现出“高抗性-高重组”的解离表型。本研究揭示了PRRSV RdRP特定残基对复制保真度的重要性，为通过靶向修饰提高减毒活疫苗的稳定性和安全性提供了理论依据。
引言
RNA病毒复制过程中突变率约为10?4–10?6/位点，其低保真度特性有助于病毒适应宿主和环境压力。RdRP作为病毒复制关键酶，直接决定复制保真度和核苷酸选择准确性。既往研究表明，RdRP突变导致的保真度变化超过四倍范围时病毒难以存活。PRRSV作为全球养猪业重要病原，其高突变率和遗传重组能力导致毒株多样性，给减毒活疫苗（MLV）应用带来毒力返祖风险。PRRSV属于尼多病毒目动脉炎病毒科，其复制转录复合体（RTC）通过模板切换产生亚基因组mRNA（sgmRNA），低保真度RTC还会生成缺失型病毒基因组（DVG）。本研究通过结构比对筛选PRRSV RdRP保真度相关残基，结合反向遗传学与高通量测序，系统评估其功能。
材料与方法
以高致病性PRRSV毒株JXwn06为模型，通过重叠PCR构建nsp9突变体感染性克隆，转染MARC-145细胞或猪肺泡巨噬细胞（PAM）拯救病毒。采用免疫荧光法（IFA）和TCID50测定病毒滴度；利用利巴韦林、5-FU、5-AZC处理评估核糖核苷类似物敏感性；通过Illumina平台测序，使用ViReMa软件分析非连续连接频率，以samtools计算突变积累量。
结果
结构比对与突变体构建
AlphaFold2建模显示PRRSV RdRP（nsp9 184-643位氨基酸）与CVB3 RdRP（PDB 3DDK）结构高度相似。比对发现I342、A394、L396、R401、T403、Y428、K541、K542等残基与CVB3保真度关键位点对应，其中K541/K542与CVB3 nsp12-K360空间位置保守。系统发育分析证实这些位点在基因2型PRRSV各谱系中高度保守。
保真度表型验证
在23个突变体中成功拯救4株病毒（A394G、L396S、R401A、K541R）。生长曲线显示K541R复制动力学优于野生型，而L396S晚期滴度显著降低。核糖核苷类似物实验中，K541R对200/400 μM利巴韦林（24/48 hpi）及50 μM 5-AZC均表现抗性；L396S仅对利巴韦林抗性增强。NGS分析表明K541R在MARC-145细胞中非连续连接频率低于野生型，突变积累量减少；但在PAM中突变积累量反而增加，提示宿主细胞环境影响保真度表型。
K336与K541的协同调控
结构建模发现K336与K541空间相邻但分居RNA通道两侧。K336R突变体虽对核糖核苷类似物抗性与K541R相似，但其连接频率较野生型升高1.6倍，而K336R+K541R双突变体频率回落，表明K541R可抑制K336R的重组倾向。K541A突变体保真度最低，连接频率和突变积累量均最高。
讨论
本研究首次通过结构比对系统性鉴定PRRSV RdRP保真度关键残基，证实RNA病毒保真度调控位点存在结构保守性。K541可能通过影响催化中心构象变化调控核苷酸掺入准确性，而K336可能参与模板结合稳定性调节。保真度突变体的宿主依赖性表型提示细胞因子可能干预RTC功能。未来需建立PRRSV RdRP体外延伸试验以阐明其动力学机制，并通过动物实验评估保真度突变体作为疫苗候选株的毒力与免疫原性。
结论
PRRSV nsp9-K541R突变可增强复制保真度，而K336、A394、L396、R401等残基突变则降低保真度。RdRP保真度决定簇的结构保守性为其他RNA病毒关键位点鉴定提供了范式，为优化减毒疫苗基因组稳定性奠定了理论基础。
