《Virulence》：The interaction between CfAda3 and CfGcn5 impacts growth, development, and virulence of Colletotrichum fructicola
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本研究通过质谱分析鉴定出果生炭疽菌（Colletotrichum fructicola）CfGcn5的互作蛋白CfAda3，系统揭示了CfAda3在组蛋白H3K18乙酰化（H3K18Ac）、基因转录全局调控、自噬（autophagy）及病原菌生长、产孢、胁迫响应和致病力中的关键作用。研究不仅阐明了CfAda3与CfGcn5协同调控真菌毒力的新机制，也为深入理解Gcn5-containing复合物在植物病原真菌中的功能提供了重要见解。
文章内容归纳总结
引言
油茶（Camellia oleifera）是亚洲多个国家重要的木本油料植物，其栽培区普遍发生的由果生炭疽菌（Colletotrichum fructicola）引起的炭疽病，每年造成重大损失。此前研究发现，CfGcn5介导的组蛋白H3乙酰化调控果生炭疽菌的毒力。为深入阐明CfGcn5的调控机制，本研究对CfGcn5的互作蛋白进行了质谱分析，并对鉴定出的CfAda3蛋白进行了功能解析。
CfAda3的鉴定及其与CfGcn5的相互作用
通过免疫共沉淀结合质谱分析，从果生炭疽菌中鉴定出一个含有保守ADA3结构域、注释为染色质重塑复合物亚基的蛋白，将其命名为CfAda3。结构预测、免疫共沉淀及酵母双杂交实验均证实CfAda3与CfGcn5存在直接相互作用。
CfAda3的亚细胞定位及对H3K18乙酰化的调控
通过cNLS Mapper网站预测发现CfAda3含有一个核定位信号区域。亚细胞定位实验显示，GFP标记的CfAda3不仅在细胞质中分布，其点状信号也与核标记H1-RFP完全共定位，表明CfAda3部分定位于细胞核。进一步通过免疫印迹分析发现，与野生型和回补菌株相比，CfADA3基因缺失突变体ΔCfada3的H3K18乙酰化水平显著降低，表明CfAda3参与调控H3K18的乙酰化。
CfAda3调控的转录组分析
对野生型和ΔCfada3突变体进行转录组测序分析。差异表达基因分析显示，在ΔCfada3突变体中，共有4064个基因的表达发生显著变化，其中1398个基因上调，2666个基因下调。基因本体富集分析表明，这些差异表达基因主要富集在细胞核相关的生物学过程中。KEGG通路富集分析显示，排名前10的富集通路中有9条与代谢相关。转录组数据还显示，与分生孢子形成相关的基因CfCOS1和CfHOX2，以及多个渗透压调节基因和内质网应激相关基因在ΔCfada3突变体中表达下调，而自噬相关基因CfATG4、CfATG10和CfATG18则表达上调。这表明CfAda3调控了包括产孢、胁迫响应和自噬在内的多个基因的表达。
CfAda3负调控自噬
鉴于CfGcn5在自噬中的关键作用，以及转录组中氮代谢通路的富集，研究推测CfAda3可能参与自噬调控。实验发现，ΔCfada3突变体对自噬诱导剂雷帕霉素更为敏感。利用自噬标记蛋白GFP-CfAtg8进行的观察和免疫印迹分析均表明，ΔCfada3突变体在自噬诱导条件下，自噬小体向液泡的运输及GFP-CfAtg8的切割水平均高于野生型，揭示了CfAda3对自噬的负调控作用。
CfAda3参与生长、产孢及致病力
在完全培养基和基本培养基上，ΔCfada3突变体的菌落直径显著小于野生型和回补菌株，且其产孢量急剧下降。致病力测定显示，ΔCfada3突变体在未受伤或受伤的油茶叶片以及苹果上均不能引起病斑，表明CfAda3是果生炭疽菌致病所必需的。
CfAda3调控分生孢子萌发和附着胞形成
为了探究ΔCfada3突变体致病力缺陷的原因，研究检测了其分生孢子萌发和附着胞形成能力。结果显示，ΔCfada3突变体的孢子萌发率仅为51%左右，且几乎观察不到附着胞的形成，而野生型和回补菌株的附着胞形成率超过71%。这表明CfAda3在分生孢子萌发和附着胞形成过程中扮演关键角色。
CfAda3在环境胁迫响应中的作用
ΔCfada3突变体对氧化胁迫模拟物H2O2表现出更高的敏感性。同时，多个氧化还原相关基因在突变体中表达下调。此外，突变体对渗透胁迫、细胞壁完整性胁迫和内质网胁迫也表现出更高的敏感性。这些结果均表明CfAda3在病原菌应对多种环境胁迫过程中发挥重要作用。
NLS区域和ADA3结构域影响CfAda3的定位
通过缺失NLS区域或ADA3结构域，研究了它们对CfAda3亚细胞定位的影响。缺失NLS区域的截短蛋白均匀分布在细胞质中，失去了核定位；而缺失ADA3结构域的截短蛋白则完全定位于细胞核，失去了细胞质定位。这说明了NLS区域和ADA3结构域对于CfAda3的正确定位都至关重要。
NLS区域和ADA3结构域参与CfAda3的功能
表型分析发现，缺失ADA3结构域的菌株在生长、产孢和致病力方面的缺陷与ΔCfada3突变体相似；而缺失NLS区域的菌株则表现出介于ΔCfada3突变体和野生型之间的中等表型。在H3K18乙酰化水平和附着胞形成方面也观察到相似的趋势。尽管缺失ADA3结构域的CfAda3仍能与CfGcn5互作，但该结构域对CfAda3的功能发挥更为关键。
CfAda3与CfGcn5协同调控生长、发育及致病力
构建了CfADA3和CfGCN5双基因缺失突变体ΔCfada3ΔCfgcn5。该双突变体在生长、产孢和致病力方面的缺陷与单基因缺失突变体ΔCfada3和ΔCfgcn5相似，未表现出叠加效应。这表明CfAda3与CfGcn5在相同的遗传通路中协同作用，共同调控果生炭疽菌的生长、发育和致病力。
讨论与总结
本研究首次在果生炭疽菌中鉴定并功能解析了CfGcn5的互作蛋白CfAda3。研究发现，CfAda3主要定位于细胞核，并与CfGcn5协同作用，通过乙酰化H3K18来全局调控基因转录。CfAda3在真菌的生长、分生孢子形成、自噬、多种环境胁迫响应以及致病力方面均发挥关键作用。NLS区域和ADA3结构域对于CfAda3的正确定位和完整功能都是必需的，其中ADA3结构域的作用更为突出。研究结果表明，CfAda3与CfGcn5在功能上紧密协同，共同构成了调控果生炭疽菌致病力的核心分子模块。这项研究不仅揭示了CfAda3在森林植物病原真菌中的新功能，也为深入理解Gcn5-containing复合物在病原真菌与寄主互作中的调控网络提供了重要线索。
