《Analytica Chimica Acta》：Standardized digital PCR assay validation using PCR-ValiPal, demonstrated in cross-platform quantification of bovine papilloma virus
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本研究开发了一款名为PCR-ValiPal的用户友好型Web应用，用于标准化和简化数字PCR（dPCR）试纸的验证流程，符合ISO 20395:2019标准。通过牛乳头瘤病毒（BPV）的三色检测案例，在四个平台（Naica、QIAcuity、LOAA、CFX96）中进行了技术验证，发现不同平台在灵敏度（如LOQ）、空白限（LOB）和线性方面存在显著差异，而PCR-ValiPal能够统一报告参数，显著提升验证效率与结果可比性。
大卫·格里鲁普（David Gleerup）|马蒂斯·温克（Matthijs Vynck）|莉安·吉森斯（Lien Gysens）|辛迪·德·巴雷（Cindy De Baere）|威姆·特里普斯汀（Wim Trypsteen）|乔·范德索姆佩莱（Jo Vandesompele）|奥利维尔·塔斯（Olivier Thas）|安·马滕斯（Ann Martens）|马滕·哈斯佩斯拉格（Maarten Haspeslagh）|沃德·德·斯皮格莱尔（Ward De Spiegelaere）
比利时根特大学兽医学院形态学、影像学、骨科、康复学和营养学系
摘要
背景
数字PCR（dPCR）通过将样本分成数千个反应单元，实现对核酸的精确和绝对定量，从而提高了重复性，并减少了对外部标准曲线的依赖。然而，严格的检测验证对于确保结果的可靠性至关重要，尤其是在检测限、定量限、准确性和线性等方面。现有的指南（如MIQE、dMIQE、ISO 20395:2019）强调了这些要求，但实际应用过程中仍存在操作繁琐且实验室间一致性不足的问题。为了解决这些问题，我们开发了PCR-ValiPal这一用户友好的网络应用程序，它标准化并简化了dPCR检测的验证和报告流程。
结果
PCR-ValiPal能够计算出符合ISO标准的所有分析参数，包括空白限（LOB）、检测限（LOD）、定量限（LOQ）、精度、准确性和线性。虽然该工具适用于任何核酸目标，但我们以牛乳头瘤病毒（BPV）的三色PCR检测为例进行了验证，该检测在四种平台上进行了基准测试：Naica（液滴dPCR）、QIAcuity（微孔dPCR）、LOAA（实时dPCR）和CFX96（qPCR）。跨平台比较显示，Naica和QIAcuity的LOB和LOQ值较低且偏差较小，而LOAA的偏差虽然稳定但呈负值。qPCR在检测BPV-2时表现最佳，但在低浓度下对BPV-1的检测效果较差。这些结果既体现了针对特定平台的优化必要性，也展示了PCR-ValiPal在提供透明、标准化验证结果方面的实用性。
意义
PCR-ValiPal支持基于PCR的检测方法的透明、可重复且符合ISO标准的验证流程，降低了专家和非专家用户的使用门槛。通过将统计分析集中在一个工具中，它促进了跨平台和目标间的可靠比较，有助于在研究、诊断和监管领域的应用。这项工作强调了标准化验证在确保核酸定量准确性方面的关键作用。
引言
数字PCR（dPCR）能够实现核酸的高精度和绝对定量，从而广泛应用于微生物学、肿瘤学、拷贝数变异和环境DNA监测等领域。dPCR通过将每个核酸样本与PCR试剂一起分配到微孔或液滴中，创建了数千个并行PCR反应容器（称为“分区”），从而可以直接计数目标分子的存在与否。这种绝对定量方法提高了精度，减少了对认证参考材料的依赖，并提升了中间精度的稳定性。尽管具有这些优势，严格的检测验证仍然是确保可靠性的关键。
尽管已有诸多指南（如qPCR的MIQE [12]、dPCR的dMIQE [13] 以及qPCR和dPCR的ISO 20395:2019 [14]）强调了详细的报告和验证要求，但这些步骤在实验操作和数据分析过程中往往较为繁琐。为了简化这一过程，我们开发了PCR-ValiPal这一网络工具，它根据ISO 20395:2019标准计算了检测验证和报告所需的所有分析参数（见表S.6 [15]）。
为了展示使用PCR-ValiPal生成的符合ISO标准的检测验证报告，我们进行了一项技术性的跨平台dPCR验证研究，研究对象是几种牛乳头瘤病毒（BPV）菌株。虽然PCR-ValiPal适用于任何目标，但这里选择BPV作为典型案例，以展示其在不同平台架构下生成标准化验证报告的实用性。
下面简要介绍BPV的生物学和临床背景，以便更好地理解这项研究。
牛乳头瘤病毒1型（BPV-1）是一种属于乳头瘤病毒科的双链DNA病毒，主要感染牛，导致上皮组织和成纤维细胞组织出现乳头瘤。值得注意的是，BPV-1在其自然宿主牛体内可引发肿瘤形成，在实验中也能在其他物种（如马）中引发肿瘤（如马肉瘤 [17]）。因此，BPV-1是研究乳头瘤病毒生物学和癌症发展的宝贵模型。
虽然在欧洲的马肉瘤病例中主要检测到BPV-1 [18]，但BPV-2也在欧洲马匹中被发现，尽管频率较低 [19]。此外，还有报道指出BPV-1和BPV-2的共感染现象。一项针对新西兰104例马肉瘤样本的研究显示，约10%的样本同时含有BPV-1和BPV-2的DNA [20]。
因此，该检测方法设计用于同时检测BPV-1和BPV-2菌株，并使用INF参考基因进行标准化。这种全面的检测对于流行病学监测和临床结果研究都非常有价值，因为了解BPV菌株的分布和共感染情况有助于制定疾病管理和治疗策略。
部分内容摘要
空白限（LOB）的定义通常为：
空白限（LOB）是指空白样本中的平均浓度除以空白样本的标准差再除以标准正态分布的95%分位数。
这一定义基于浓度呈正态分布的假设。然而，在实际操作中这一假设经常被打破：对于优化良好的检测方法，大多数阴性对照反应的浓度应为零。PCR-ValiPal采用了一种替代方法来估算实际的95%置信区间。
使用PCR-ValiPal生成校准报告
PCR-ValiPal是一款基于Web的应用程序，旨在根据ISO 20395:2019标准进行PCR检测验证。用户需上传标准格式（CSV）的PCR数据，其中一列包含预期浓度，另一列按实验批次或日期组织测量浓度。该平台随后使用统计方法计算空白限（LOB和LOD两种类型）、定量限（LOQ两种类型）、精度（重复性和中间精度）、准确性和线性等参数。
结论
总体而言，不同平台的检测性能存在差异，且高度依赖于具体的检测目标。两种dPCR系统（QIAcuity和Naica）均表现出较高的灵敏度（尤其是对BPV-1和IFN）、较低的LOB和LOQ值以及出色的线性，同时与预期浓度的偏差较小，表明其具有很高的准确性。LOAA同样表现出良好的线性，并且在单次检测中的精度也较高；然而，
CRediT作者贡献声明
辛迪·德·巴雷（Cindy De Baere）：研究工作。莉安·吉森斯（Lien Gysens）：撰写、审稿与编辑、研究、数据分析。马蒂斯·温克（Matthijs Vynck）：撰写、审稿与编辑、初稿撰写、验证、软件开发、数据分析、概念设计。大卫·格兰让·格里鲁普（David Grandjean Gleerup）：初稿撰写、数据可视化、方法设计、研究、数据分析、数据整理。沃德·德·斯皮格莱尔（Ward De Spiegelaere）：撰写、审稿与编辑、项目监督、资金争取、概念设计。
利益冲突
Optolane、Stilla和Qiagen公司的仪器在实验期间由制造商免费提供。数据和材料的可用性
所有用于分析参数估计的数据均包含在补充数据文件中。其他数据（PCR文件）可应要求提供。写作过程中使用生成式AI和AI辅助技术的声明
作者使用ChatGPT（OpenAI）辅助语言编辑，以提高手稿的清晰度。所有科学内容、分析和结论均由作者自行完成。资助
本研究得到了根特大学（Ghent University）跨学科研究基金的资助（编号：01IO0420）。利益冲突声明
沃德·德·斯皮格莱尔（Ward De Spiegelaere）声明：QIAGEN公司提供了实验所需的设备、药物或耗材；沃德·德·斯皮格莱尔还声明Optolane和Stilla Technologies公司也提供了相关设备或耗材。如果还有其他作者，他们声明自己没有已知的利益冲突。
致谢
作者感谢根特大学（Belgium）的DIGPCR核心设施（BOF/COR/2025/001）在数字PCR实验中提供的支持。本研究还得到了根特大学跨学科研究基金（编号：01IO0420）的资助。
