一种无需扩增的、原位检测miRNA-451的方法，该方法利用单纳米粒子LSPR生物传感技术实现，并应用于多通道微流控芯片上

《Analytical Biochemistry》：An amplification-free and in situ detection system for miRNA-451 with single-nanoparticle LSPR biosensing on a multi-channel microfluidic chip

【字体：大中小】 时间：2026年02月08日 来源：Analytical Biochemistry 2.5

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　　早期筛查结直肠癌（CRC）对降低死亡率至关重要。本研究开发了一种基于局部表面等离子共振（LSPR）的无放大高灵敏检测系统，集成多通道微流控芯片平台，利用金纳米颗粒（AuNPs）探针特异性捕获CRC标志物miRNA-451，实现检测限19.2 fM。通过单纳米粒子追踪策略，结合微流控芯片的空间同位检测，有效消除视野差异导致的采样误差，同时解耦杂交与检测功能，显著提升检测效率和准确性。

天津南开大学电子信息与光学工程学院，中国天津300350

摘要

早期筛查结直肠癌（CRC）对于降低其死亡率至关重要。本研究开发了一种无需扩增、高灵敏度的传感系统，该系统基于局域表面等离子体共振（LSPR）技术，并与多通道微流控芯片平台集成，利用金纳米颗粒（AuNPs）原位检测关键的CRC生物标志物microRNA-451（miRNA-451），实现了19.2 fM的检测限（LOD）。该系统的核心是一个多通道微流控芯片，作为检测基底，单链DNA（ssDNA）探针固定在AuNPs表面以构建传感器。在目标miRNA-451存在的情况下，它会与两种类型的ssDNA探针特异性杂交，导致AuNPs二聚体的形成，从而引起其LSPR散射光谱的红移。与传统方法不同，本研究采用了一种精确的单纳米颗粒跟踪策略，通过统计分析同一视野（FOV）内表现出显著光谱红移的AuNPs的比例来量化目标。这种方法有效减少了由于FOV不一致引起的空间采样误差。此外，该系统将“杂交”和“检测”功能分离，显著提高了检测效率和准确性。这项工作为无需扩增且高灵敏度地检测miRNA-451提供了一个可靠的技术平台。

引言

结直肠癌（CRC）是一种消化道恶性肿瘤，具有全球较高的发病率和死亡率[1]，[2]。由于该疾病在早期和中期阶段通常缺乏典型的临床症状，大多数患者在晚期才被诊断出来[3]，因此迫切需要早期筛查以降低CRC的死亡率[4]。尽管结肠镜检查是目前最有效和可靠的CRC检测方法，但其侵入性和高成本限制了其广泛应用[5]。

最近的研究表明，特定microRNA（miRNA）的表达水平与结直肠癌的发生和发展密切相关[6]。miRNA在细胞转移、增殖和凋亡等过程中起着关键作用，这些过程被认为是CRC发病机制的标志[7]。由于miRNA在非侵入性液体（如血液和粪便）中具有高稳定性且易于检测，因此具有很大的研究潜力[8]。在各种miRNA中，生物标志物miRNA-451在多种恶性肿瘤中广泛失调[9]，[10]，尤其在CRC的发展和进展中起着关键作用[11]，[12]。

已经开发了多种miRNA检测技术[13]。传统方法包括Northern blotting[14]，[15]、逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）[16]，[17]，[18]和微阵列分析[19]，[20]。Northern blotting曾经是最广泛使用的方法，但其结果半定量、通量低、操作繁琐且灵敏度有限。RT-qPCR因其出色的灵敏度、宽动态范围和高特异性而被认为是目前miRNA检测的金标准，但面临引物设计复杂、假阳性率高等挑战，以及由于操作步骤复杂而难以确保定量精度的问题。微阵列分析可实现高通量和快速检测，但成本较高，且在分析短链或高度相似的miRNA时表现不佳。

金纳米颗粒（AuNPs）因其高表面积与体积比、优异的导电性和化学稳定性而在miRNA检测中得到了广泛研究和应用[21]，[22]，[23]。局域表面等离子体共振（LSPR）是一种现象，指的是当入射光的波长大于纳米颗粒尺寸时，金属纳米颗粒（如AuNPs）中的传导电子集体振荡[24]。LSPR生物传感器通过监测目标分析物与表面固定探针特异性结合引起的局部折射率变化，将这些变化实时转换为LSPR光谱峰值的移动[25]。这种光学检测机制能够实现高灵敏度、无标记的定量分析，同时有效减少背景噪声[26]。此外，LSPR传感器还具有成本低、操作简便以及与芯片实验室或即时检测（POC）设备兼容等优点，使其适用于检测小分子生物标志物[27]，[28]。

为了检测复杂生物样本（如血液或粪便）中极低浓度的miRNA，LSPR技术经常与信号放大策略结合使用，如滚环扩增（RCA）[29]，[30]、杂交链反应（HCR）[31]，[32]和催化发夹组装（CHA）[33]，[34]。虽然这些策略显著提高了灵敏度，但也可能引入假阳性信号，并使复杂生物基质中的绝对定量变得复杂。因此，迫切需要无需标记或扩增步骤的定量miRNA检测平台。

原位检测是一种通过在同一位置实时连续监测分析物来提高准确性和可靠性的策略，在表面增强拉曼散射（SERS）[35]，[36]、表面等离子体共振（SPR）[37]，[38]和LSPR[39]，[40]等技术中显示出优势。然而，SPR技术存在系统复杂性、设备成本高以及对非特异性吸附敏感的问题。SERS受基底依赖性的限制，并且在信号重复性和稳定性方面存在问题。因此，本研究将原位策略与LSPR技术相结合，通过跟踪同一批固定纳米探针在反应前后的LSPR光谱变化，有效克服了传统方法中与FOV变化相关的空间采样误差。

在这里，我们构建了一个集成传感系统，将基于LSPR的原位检测策略与多通道微流控芯片结合，用于检测CRC相关生物标志物miRNA-451（图1）。该系统旨在通过直接跟踪单个AuNPs二聚体的形成来避免复杂的信号放大步骤，实现无需扩增、高灵敏度和并行原位分析目标miRNA-451。系统的核心是通过Au-S共价键将硫醇（SH-）修饰的ssDNA探针固定在AuNPs上，并与多通道微流控芯片集成，构建高性能生物传感系统。微流控芯片是通过将顶部羟基化和图案化的PDMS层与底部胺化的二氧化硅（SiO₂）滑块粘合而成。对于检测，用特定DNA探针1修饰的AuNPs通过静电吸附固定在胺化微流控芯片上，并使用暗场显微镜记录其初始LSPR散射光谱。随后，目标miRNA-451在溶液中与用DNA探针2修饰的AuNPs预杂交。然后将这种混合物注入芯片通道进行进一步杂交。如果存在miRNA-451，它将作为“桥梁”，促进两个AuNPs之间的“握手”形成二聚体结构，引起LSPR散射光谱的红移。在没有目标miRNA-451的情况下，AuNPs保持分散状态，不会发生光谱移动。与传统方法依赖于FOV内大量纳米颗粒的光谱平均值不同，这种方法有效消除了由FOV变化引起的空间采样误差，显著提高了检测准确性和灵敏度。

试剂和材料

柠檬酸钠缓冲液（0.1M，pH=3，MAKLIN），氯金酸（HAuCl₄，konoscience），TE缓冲液（无DNase和RNase，pH = 8，Solarbio），聚二甲基硅氧烷（PDMS，SYLGARD），无水乙醇（C₂H₅OH，99%，MERYER），3-氨基丙基三甲氧基硅烷（APTMS，97%，MAKLIN），三（2-羧乙基）膦盐酸盐（TCEP，aladdin），柠檬酸钠生理盐水缓冲液（20×SSC，pH=7.4，Solarbio），硫酸（H₂SO₄，98%，YUANDONG），过氧化氢（H₂O₂，30%，DAMAO）。所有寡核苷酸均从Sangon购买

AuNPs的模拟和最佳尺寸的确定

由于所开发的传感器基于AuNPs的LSPR效应，我们使用Lumerical FDTD软件对不同尺寸的单个AuNPs及其二聚体进行了模拟，以确定实验中最佳的AuNPs直径。模拟结果显示，对于单个AuNPs，随着直径的增加，散射峰没有显著的红移（图1(a)）。然而，对于AuNPs二聚体，随着直径的增加，散射峰显示出明显的红移（图1(b)）。

结论

本研究成功构建了一个集成传感系统，将多通道微流控芯片与LSPR技术结合，实现了无需扩增且高灵敏度的关键结直肠癌生物标志物miRNA-451的分析检测。核心创新在于采用单纳米颗粒光谱跟踪策略，通过统计分析FOV内表现出LSPR散射光谱红移的AuNPs的比例来量化目标。

CRediT作者贡献声明

Zhijia Bao：可视化，软件。Haiying Chen：验证。Xinyu Zi：撰写——审阅与编辑，验证，软件。Jianqi Wang：方法学，数据管理。Mingqing Zhang：数据管理。Xinyu Gao：数据管理。Guohua Liu：撰写——审阅与编辑，项目管理，资金获取。Kuilin Liu：撰写——原始草稿，可视化，验证，软件，方法学，数据管理