《Aquatic Toxicology》：Environmental Standard Limit Fluoride Exposure Prioritizes Neurotoxicity Over Osteotoxicity in Larval Zebrafish: A Benchmark Dose Analysis
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氟化物对中枢神经系统（CNS）和骨骼系统的毒性效应及敏感性比较。采用斑马鱼模型，通过行为学、转录组学和基准剂量模型（BMD/BMC）分析，发现CNS在0.5-20.0 mg/L浓度范围内即出现神经兴奋（0.5 mg/L）和基因表达异常（如neun、tmem119a显著上调），而骨骼系统仅在高浓度（20.0 mg/L）时出现矿化抑制。BMA结果显示CNS的BMCL??（0.17 mg/L）为骨骼系统BMCL??（1.83 mg/L）的1/10，证实CNS对氟化物更敏感。现行以骨骼毒性为基准的水质标准（如WHO的1.5 mg/L）可能低估神经发育风险，需重新评估。
杨秀梅|张仙梅|建国军|朱圆辉|陈航宇|穆晓曦|李杰|朱碧珍|卢慧|安燕|金婷旭
公共卫生学院，环境污染监测与疾病控制重点实验室，教育部，贵州医科大学，贵阳561113，中国
摘要
氟化物是一种广泛存在的环境污染物，但目前基于骨骼毒性的水质标准可能低估了其对神经发育的风险。本研究使用斑马鱼幼体，直接比较了中枢神经系统（CNS）和骨骼系统在0.5–20.0 mg/L浓度范围内的氟化物敏感性，这些浓度涵盖了国际监管限制。通过结合行为学、转录组学和基准剂量建模的方法进行了综合评估。氟化物在大脑中的积累呈剂量依赖性，并在0.5 mg/L浓度下引发了过度活动，表明存在神经兴奋现象。相比之下，骨骼变化呈双相性，仅在20.0 mg/L浓度下出现矿化减少。转录组学显示，与骨骼相关的通路相比，中枢神经系统相关通路的富集程度更高。一致地，关键神经标志物（neun, tmem119a）在所有浓度下均上调，而骨骼标志物（bglap, acp5b）的反应则不一致。贝叶斯模型平均结果表明，中枢神经系统标志物的平均基准浓度下限为0.17 mg/L，比骨骼标志物的下限（1.83 mg/L）低一个数量级。这些结果定量证实，在监管水平的暴露下，发育中的中枢神经系统比骨骼系统更敏感。这种显著的敏感性差异表明，主要基于骨毒性的标准可能无法充分保护免受神经发育影响。需要进一步的研究将这些基于生物标志物的阈值转化为功能性结果，以进行全面健康风险评估。
引言
氟被认为是电负性最强的卤素，在环境中主要以氟化物化合物的形式存在。这些化合物来源于自然来源（如矿物浸出、火山排放和海洋气溶胶）以及人为活动（包括工业和农业生产以及煤炭燃烧）（Kashyap等人，2021年）。由于其高溶解度和环境持久性，氟化物容易污染全球的水体，已有超过100个国家报告了地下水污染（Schlesinger等人，2020年；Shaji等人，2024年）。此外，许多地区的公共饮用水氟化是另一个重要的暴露途径（国家健康与医学研究委员会，2017年；美国疾病控制与预防中心，2024年；Yee等人，2025年）。总体而言，水是人类接触氟化物的主要途径。
氟化物对人类健康的影响主要取决于剂量（Solanki等人，2022年）。在低浓度下，氟化物对骨骼矿化和牙釉质形成很重要；然而，超过安全阈值的浓度（例如，饮用水中超过1.5 mg/L）可能导致病理状况，如骨骼和牙齿氟斑牙（Srivastava和Flora，2020年）。为了保护公众健康，许多国家和国际组织制定了氟化物的环境标准，以其对硬组织的不良影响作为关键终点。典型的限制包括世界卫生组织（WHO）和欧盟规定的1.5 mg/L（世界卫生组织，2022a年；欧盟，2020年），以及美国环境保护署（US EPA）规定的4.0 mg/L（主要限制）和2.0 mg/L（次要限制）（美国环境保护署，2021年，2024年）。在本研究中，我们将这些监管限制统称为“环境标准限制浓度（ESLC）”。
然而，这些标准可能无法充分解决氟化物对非骨骼组织，特别是神经系统的毒性作用。发育中的中枢神经系统（CNS）特别容易受到环境污染物的影响，这可能是由于发育期间血脑屏障的通透性增加以及先天防御机制的不完全成熟（Bear等人，2015年；Farmus等人，2021年）。氟化物能够穿过血脑屏障，可能改变神经回路的结构和功能。这些改变可能损害学习和记忆，并导致神经精神变化（Shalini和Sharma，2015年；Dec等人，2019年；Xin等人，2023年）。流行病学研究表明，早期接触氟化物会损害儿童的智力发育（Yu等人，2018年；Xia等人，2024年；Taylor等人，2025年）。越来越多的证据表明，氟化物的安全摄入量可能低于当前的监管限制。例如，2023年在中国和美国进行的研究表明，水中氟化物浓度超过大约1.0 mg/L（中国各种水源的监管限制）与儿童智力显著下降有关（Zhao等人，2021年；Veneri等人，2023年）。重要的是，与导致骨骼损伤的氟化物浓度相比，这些神经发育效应相关的氟化物浓度要低得多（National Research，2006年）。因此，有必要研究中枢神经系统是否对氟化物表现出更大的敏感性。
“ESLC”一词指的是各种水质标准中规定的氟化物浓度限制。传统上，这些限制是根据未观察到不良效应水平（NOAEL）和最低观察到不良效应水平（LOAEL）得出的（More等人，2022年）。然而，NOAEL/LOAEL方法存在若干局限性，包括高度依赖实验设计以及无法模拟连续的剂量-反应关系（美国环境保护署，2012年）。为了克服这些缺点，美国环境保护署（EPA）和欧洲食品安全局（EFSA）建议使用基准剂量（BMD）或基准浓度（BMC）方法进行健康风险评估（HRA）（美国环境保护署，2012年；More等人，2022年）。BMD/BMC方法应用统计模型对剂量-反应数据进行建模，以估计产生预定基准反应（BMR）的浓度（BMD/BMC）。该估计的置信下限称为基准剂量下限（BMDL）或基准浓度下限（BMCL）（美国环境保护署，2012年；More等人，2022年）。鉴于不同的统计模型可能产生不同的BMD/BMC估计值，因此开发了贝叶斯模型平均（BMA）方法，通过其统计支持度对多个合理模型的结果进行整合（Madigan和Raftery，1994年；Kaplan，2021年）。
本研究关注基因表达作为分子水平的指标，因为它提供了早期反应、高精度的连续定量数据，并有可能作为不良结果的早期生物标志物（Bourdon-Lacombe等人，2015年）。这些特点使我们能够应用BMD/BMC建模来推导中枢神经系统和骨骼系统的毒性阈值（BMCL??），从而为比较它们对氟化物的相对敏感性建立定量基础。
选择合适的模式生物同样至关重要。斑马鱼是这方面的理想模型，它在神经毒性研究中具有三个主要优势：与人类的高度遗传和信号通路同源性、大脑区域和行为的功能相似性，以及胚胎透明性，便于直接实时观察中枢神经系统（Martin和Plavicki，2020年；Fontana等人，2022年；Wang等人，2023年）。对于骨骼研究，斑马鱼具有类似哺乳动物的发育过程和光学可及性，可以通过活体染色实时观察骨骼形成和矿化（Valenti等人，2020年）。由于这些综合优势，斑马鱼已成为生命科学中第三大常用的模式生物。
为了解决关于中枢神经系统和骨骼系统在ESLC下相对敏感性的关键数据空白，本研究使用斑马鱼模型系统地评估和比较了氟化物对这两个系统的毒性。我们将5 dpf的斑马鱼暴露在涵盖ESLC的氟化物浓度梯度下。进行了多层次评估，包括神经行为和成骨表型、转录组分析以及关键分子标志物的mRNA表达，并利用BMA BMC建模进行了定量风险评估。这种综合方法旨在确定中枢神经系统或骨骼系统哪个对氟化物更敏感，从而为完善氟化物的水质标准提供科学依据。
化学物质和试剂
氟化钠（NaF；纯度≥99%）从天津志远化学试剂有限公司（中国天津）购买。氟离子探针Coumarin（4-(三氟甲基)-7-(三异丙基硅氧基)-2H-chromen-2-one；CAS 1299464-59-7）从Heliosense Biotechnologies, Inc.（中国厦门）获得。Trizol试剂、逆转录试剂盒和SYBR Green RT-PCR试剂盒从Vazyme Biotech Co., Ltd.（中国南京）购买。Alizarin Red S和Alcian Blue 8GX从Sigma Aldrich购买。
早期生命阶段氟化物暴露对斑马鱼幼体的致死和致畸效应
在测试的浓度范围内，氟化物暴露并未在2 hpf至5 dpf的斑马鱼中引起显著的全身毒性。累积死亡率、孵化率、畸形率和体长与对照组相比没有显著差异（图1A-D）。
斑马鱼幼体大脑中氟化物的检测和分布
用氟离子探针染色后，5 dpf的斑马鱼大脑中观察到荧光强度随浓度的增加而增加。
讨论
氟化物是一种广泛存在的环境污染物，其毒理学风险主要基于骨骼终点进行监管（Sotili等人，2025年）。然而，新兴的流行病学证据表明，低水平暴露与儿童神经认知缺陷有关，而当前的标准并未解决这一问题（Green等人，2019年；Zhao等人，2021年；Veneri等人，2023年）。我们的综合研究结合了表型分析、转录组学和定量风险建模方法
结论
基于行为表型、分子生物标志物和定量风险模型的综合分析，本研究系统地证明了在ESLC下，发育中的中枢神经系统对氟化物的敏感性高于骨骼系统。这在中枢神经系统生物标志物变化的BMCL??显著较低（平均值=0.17 mg/L）中得到了定量体现，比骨骼生物标志物的BMCL??（平均值=1.83 mg/L）低一个数量级。这些发现表明
CRediT作者贡献声明
杨秀梅：概念构思、方法学、可视化、撰写——初稿。
张仙梅：数据管理、调查、验证、可视化。
建国军：软件、可视化。
朱圆辉：方法学。
陈航宇：调查。
穆晓曦：正式分析。
李杰：软件。
朱碧珍：调查。
卢慧：软件。
安燕：资源、监督。
金婷旭：资金获取、项目管理、监督、撰写——审稿和编辑。
资助
本工作得到了贵州省科学技术部门（项目编号[2020]）、贵州省卫生健康委员会科学技术基金会（gzwkj 2024-481）、贵州省研究生研究基金项目（2024YJSKYJJ307）以及贵州省大学生创新创业培训计划（26252030653）的资助。
伦理方面
鱼类的实验遵循了OECD指南第236号和第212号。贵州医科大学伦理委员会批准了该实验方案，批准编号为2303262，如需可提供批准证明。
CRediT作者贡献声明
杨秀梅：撰写——初稿、可视化、方法学、概念构思。
张仙梅：可视化、验证、调查、数据管理。
建国军：可视化、软件。
朱圆辉：方法学。
陈航宇：调查。
穆晓曦：正式分析。
李杰：软件。
朱碧珍：调查。
卢慧：软件。
安燕：监督、资源。
金婷旭：撰写——审稿与编辑、监督、项目管理、资金获取。
