《Biomaterials》：An Off-the-Shelf Bioactive EV Delivering Cryogel Orchestrating Immunomodulatory Reprogramming and Angiogenesis for Diabetic Ulcer Healing
编辑推荐：
糖尿病足溃疡慢性炎症、缺氧和氧化应激导致愈合障碍，传统治疗效率低。本研究开发多功能Bioactive Oxygenated Off-the-Shelf EV Therapy（BOOST）冻干支架，集成脱脂干细胞外泌体（EVs）、氧气缓释及抗氧化功能。实验证实 lyophilized EVs 保留形态与功能，6个月4℃储存后仍能有效调控巨噬细胞极化（M1→M2），抑制8-OHdG氧化损伤，促进VEGF介导的血管生成和COLI/IIIA胶原重塑，加速伤口愈合。该平台通过协同免疫调节、氧供及抗氧化机制，为糖尿病足提供稳定、长效的离体疗法解决方案。
帕尔瓦伊兹·艾哈迈德·谢赫（Parvaiz Ahmad Shiekh）|乌拜德·塔里克（Ubaid Tariq）|杜尔加·南迪尼·阿特穆里（Durga Nandini Athmuri）|普雷尔纳·辛格（Prerna Singh）|贾扬塔·巴塔查里亚（Jayanta Bhattacharyya）|阿肖克·库马尔（Ashok Kumar）|纳雷什·巴特纳加尔（Naresh Bhatnagar）
SMART实验室，生物医学工程中心，印度理工学院德里分校，Hauz Khas，新德里-110016
摘要
慢性糖尿病足溃疡（DFUs）的特点是持续的炎症、氧化应激和缺氧，导致愈合能力受损以及治疗效果有限。虽然细胞外囊泡（EVs）在调节免疫微环境和促进再生方面具有潜力，但其临床应用受到储存过程中不稳定性和功能丧失的限制。作为替代方案，能够释放氧气的支架展示了再生潜力，并可作为EVs的输送系统。在这里，我们介绍了一种多功能、生物活性的即用型氧合EV疗法（BOOST），该疗法将冻干EVs、氧气释放和免疫调节功能集成在单一的冷冻凝胶支架中。BOOST通过协同作用重新编程免疫系统，将巨噬细胞从促炎型M1表型转变为促再生型M2表型，同时促进血管生成和胶原蛋白重塑。作为一种即用型疗法，BOOST在6个月内保持了EV的生物活性，持续释放氧气并减少了ROS，加速了糖尿病伤口的闭合。BOOST还重新编程了巨噬细胞的极化，上调了抗炎因子IL10的水平，促进了血管生成（VEGF、CD31）、胶原蛋白合成（COL1A和COLIIIA），并促进了毛囊再生，同时减轻了氧化应激（8-OHdG）。这项工作提出了一种临床相关的策略，将EV疗法与氧气输送和免疫调节相结合，以应对多种病理生理障碍，为DFUs提供了一种有效的即用型治疗方案。
引言
糖尿病足溃疡是全球范围内一个重要且日益严重的健康问题。这些慢性不愈合的伤口会导致感染和截肢的风险增加[1]、[2]、[3]。糖尿病溃疡愈合能力受损的原因是多方面的，包括持续的炎症、组织缺氧、氧化应激加剧以及基质重塑失调[4]、[5]。尽管有标准的治疗方法，但DFU的愈合成功率仍然很低，这凸显了需要创新和多功能治疗手段的必要性[6]、[7]。
不愈合的糖尿病伤口的一个关键特征是它们长期处于炎症阶段，表现为活性氧（ROS）的产生增加、缺氧以及以促炎型M1巨噬细胞为主的巨噬细胞塑性改变。这导致上皮再生延迟和新血管形成受阻，从而导致基质重塑不良和伤口闭合不完全[4]、[5]、[8]。在健康情况下，身体会通过增加血流量来输送组织修复所需的氧气和必需营养素。然而，在糖尿病情况下，由于外周血管并发症，这些伤口的氧气供应受到限制，尤其是下肢部位，从而阻碍了再生[9]、[10]。
氧气在伤口愈合的每个阶段都起着关键作用，包括成纤维细胞增殖、胶原蛋白交联、角质形成细胞迁移以及最重要的新血管生成。缺氧会通过破坏缺氧诱导因子（HIFs）和血管内皮生长因子（VEGF）显著延缓内皮细胞增殖和毛细血管网络成熟。因此，在再生过程中，持续和局部的氧气供应对于促进内皮细胞存活、迁移和新形成的血管稳定至关重要[11]、[12]、[13]、[14]、[15]。
最近的再生方法专注于使用细胞外囊泡（EVs）作为一种有前景的替代方案，因为它们能够调节炎症、刺激血管生成并促进组织修复[16]、[17]、[18]、[19]、[20]、[21]。来自干细胞的EVs在加速伤口愈合方面表现出显著潜力，通过促进血管生成、调节免疫反应和增强组织再生[22]、[23]、[24]、[25]、[26]。然而，EV疗法的广泛应用受到可扩展性、储存和按需可用性等实际挑战的阻碍。新鲜的EV制剂需要严格的冷链储存，并且容易失去功能，限制了其可获取性和临床实用性[27]、[28]、[29]、[30]。
为了克服这些障碍，基于生物材料的支架被探索作为EV的载体，以实现可控和局部的输送，并为伤口部位的组织修复和再生提供结构支持[31]、[32]、[33]。然而，大多数支架缺乏对抗糖尿病伤口愈合中关键生理挑战（如缺氧和氧化应激）的互补功能[34]。此外，这种支架还会促进感染的发生，因为免疫细胞的效率较低[35]、[36]、[37]。因此，同时针对缺氧和氧化应激对于重建愈合微环境至关重要。在这方面，释放氧气的支架在改善伤口愈合结果方面显示出潜力[34]、[38]、[39]、[40]、[41]、[42]、[43]、[44]、[45]。然而，将氧气输送、抗氧化防御和EVs结合在单一的即用型治疗敷料中的研究还很不充分。
在这项研究中，我们介绍了生物活性氧合即用型EV疗法（BOOST）的开发。主要目标是证明这一多功能平台的概念验证，该平台集成了冻干EVs、氧气释放和抗氧化特性。BOOST被设计为一种即用型伤口敷料，以确保EV的稳定性，延长其保质期，释放氧气，减少氧化应激，同时为临床应用提供灵活性。
总体而言，BOOST为DFU治疗提供了一种潜在的变革性方法。我们首先评估了冻干对EVs结构和功能特性的影响。冻干后的EVs能够在不进行零下温度储存的情况下保持其结构完整性、生物力学和功能性。接下来，我们通过一系列体外实验评估了BOOST的物理化学和再生特性。BOOST表现出强烈的免疫调节作用，减少了促炎型M1巨噬细胞的表达，增加了抗炎型M2巨噬细胞的表达。此外，BOOST还减轻了人类角质形成细胞中的缺氧和氧化应激。为了评估其作为即用型、即用型敷料的转化潜力，我们评估了其在4°C下储存6个月后的结构和生物学性能，结果显示其功能与新鲜敷料相当。此外，在慢性糖尿病溃疡模型中，BOOST增加了细胞存活率，重新编程了免疫微环境，增强了新血管生成，促进了胶原蛋白成熟，并实现了功能性皮肤再生。我们还阐明了其作用机制，即氧气释放和EVs通过免疫调节和促进血管生成共同促进伤口愈合（图1）。综上所述，这些发现表明BOOST是一个结合了氧气输送、抗氧化防御和基于EV的疗法的协同平台，为慢性糖尿病伤口愈合提供了一种多功能且具有临床转化性的策略。
部分摘录
冻干后的EVs保持了其形态学、结构和生物力学特性
在这项研究中，我们设计并评估了一种用于糖尿病足溃疡的生物活性氧合即用型EV疗法（BOOST）。BOOST疗法包含一个含有从脂肪来源的干细胞中分离出的细胞外囊泡（EVs）的冷冻凝胶支架。这种疗法是一种多功能方法，有助于恢复DFUs中的细胞动态，对伤口愈合至关重要。EVs与氧气的结合通过提供
BOOST的活性机制及其局限性
BOOST敷料的治疗效果源于其多功能设计，该设计在一个系统中结合了氧气生成、EV输送和ROS减轻。该系统通过持续的EV输送和氧合作用调节伤口微环境，从而实现双重作用。BOOST通过减轻局部缺氧显著减少了氧化应激，这通过DCFDA和8-OHdG阳性水平的降低以及细胞内缺氧的减轻得到了证实。同时，冻干的EVs进一步
结论
总之，本研究表明BOOST是一种多功能治疗平台，能够通过协同的氧气和EV输送来调节伤口微环境。BOOST有效减轻了炎症，促进了促再生免疫调节和血管生成。这种创新的伤口敷料设计满足了市场对商业上可行的、即用型再生疗法的迫切需求。其抗氧化和氧气释放
EV的分离和冻干
除非另有说明，所有化学品和试剂均从Sigma-Aldrich（美国）购买。EVs是从脂肪来源的干细胞（ADSCs）中分离得到的。为了分离ADSCs，从1.5个月大的雌性Sprague-Dawley（SD）大鼠的腹股沟和肾周区域收集了柔软的脂肪组织（批准编号IITK/IAEC/2021/1123）。组织用PBS彻底清洗后，使用L-15培养基中制备的0.5%胶原酶I溶液进行酶解。脂肪消化时间为1
作者贡献声明
杜尔加·南迪尼·阿特穆里（Durga Nandini Athmuri）：撰写——原始草稿、验证、研究。普雷尔纳·辛格（Prerna Singh）：可视化、方法学、研究。帕尔瓦伊兹·艾哈迈德·谢赫（Parvaiz Ahmad Shiekh）：撰写——审阅与编辑、撰写——原始草稿、验证、项目管理、方法学、研究、资金获取、正式分析、数据管理、概念化。乌拜德·塔里克（Ubaid Tariq）：撰写——审阅与编辑、撰写——原始草稿、可视化、验证、方法学、研究、正式分析、数据管理。
数据可用性声明
支持本研究结果的数据可向相应作者索取。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
作者声明以下财务利益/个人关系可能被视为潜在的利益冲突：
帕尔瓦伊兹·谢赫（Parvaiz Shiekh）报告称获得了印度政府科技部的财政支持。帕尔瓦伊兹·谢赫和阿肖克·库马尔（Ashok Kumar）拥有专利
致谢
这项工作得到了印度政府科技部的财政支持。PAS感谢DST INSPIRE教师奖学金的财政支持。U.T.感谢印度政府教育部提供的总理研究奖学金（PMRF）。P.S.感谢DBT在IIT Kanpur提供的研究助理奖学金。
