胃蛋白酶水解卵转铁蛋白对H?O?诱导的SH-SY5Y神经元细胞氧化损伤的神经保护作用

《Bioorganic Chemistry》：Neuroprotective effects of pepsin-hydrolyzed ovotransferrin on H 2O 2-induced oxidative damage in SH-SY5Y neuronal cells

神经保护作用；酶解卵转铁蛋白；抗氧化活性；细胞凋亡；生物活性肽

　　

金亨真（Hyeong-Jin Kim）| 余承宇（Seung-Woo Yu）| 金基泰（Kee-Tae Kim）| 安东旭（Dong-Uk Ahn）| 李娜琼（Na-Kyoung Lee）| 朴贤东（Hyun-Dong Paik）

韩国首尔05029，建国大学动物资源食品科学与生物技术系

摘要

神经退行性疾病由于缺乏有效的治疗方法和会对大脑功能造成严重损害，因此被视为极其严重的疾病。卵转铁蛋白（一种卵白蛋白）及其通过蛋白酶水解得到的产物已被报道具有多种生物活性作用。本研究旨在探讨酶解卵转铁蛋白在暴露于氧化应激的SH-SY5Y细胞中的神经保护作用。结果发现，酶解卵转铁蛋白的抗氧化活性高于纯卵转铁蛋白。此外，0.5 mg/mL的胃蛋白酶衍生卵转铁蛋白水解物（OHPE）能够显著提高细胞存活率（81.89%），有效减少细胞内活性氧（ROS）的积累（72%），并降低细胞凋亡率（46.41%）。这些抗凋亡和抗氧化作用是通过调节Bax、Bcl-2、caspase-9、caspase-3、Nrf2和HO-1的mRNA及蛋白质表达实现的。此外，利用LC-MS/MS技术鉴定出OHPE中的9种肽，并将其序列与数据库中的已知序列进行比对，以评估其作为抗氧化剂的潜力。这些结果表明，OHPE作为一种天然化合物，可通过抑制ROS的相互作用和调节神经元细胞中的蛋白质表达来预防神经退行性疾病。

引言

阿尔茨海默病、亨廷顿病和帕金森病等神经退行性疾病与衰老及活性氧（ROS）的过量产生密切相关[1]。ROS包括过氧化氢（H₂O₂）、羟基自由基（OH^•）和过氧基自由基（ROO^•），它们既可能来自外部环境，也可能由细胞内部产生[2]。虽然适量的ROS和正常的抗氧化系统对细胞代谢至关重要，但ROS的过量产生及抗氧化系统的失调会破坏细胞的正常代谢过程，从而导致氧化应激[3]。氧化应激会导致细胞内部损伤，如线粒体功能障碍，最终引发细胞死亡，包括凋亡[4]。尤其是神经元细胞，由于它们消耗大量氧气、含有高比例的不饱和脂肪酸以及有限的再生能力，因此更容易受到氧化损伤[5]。神经元细胞（包括中枢神经系统中的神经元和胶质细胞）各自执行不同的功能，并相互协作以维持系统的稳定微环境[6]。鉴于目前尚缺乏有效的治疗方法，预防神经退行性疾病具有重要意义。

生物活性肽由通过肽键连接的氨基酸组成，有助于改善健康和生理功能。目前已发现超过1000种具有多种已知功能的生物活性肽[7]。肽的功能受多种因素影响，如氨基酸组成和序列、结构、分子量以及pH值[8]。这些肽的制备通常涉及多种生化或物理过程，例如发酵、酸水解或使用蛋白酶对来自动物、植物或食品工业副产品的蛋白质进行酶解[9]。在这些方法中，酶解法具有诸多优势，包括蛋白酶的高底物特异性、提升的营养价值以及环保性[10]。

蛋白酶是一类能够水解肽或蛋白质中肽键的酶。许多蛋白酶来源于植物、动物和微生物。根据作用机制，蛋白酶通常被分为外肽酶和内肽酶：外肽酶作用于肽的氨基端或羧基端，而内肽酶则特异性地切割蛋白质内部的氨基酸序列[11]。与从肽的外部位置释放氨基酸或二肽的外肽酶不同，内肽酶能够将完整蛋白质中的特定位置切割成小片段[12]。

卵转铁蛋白（OTF）是卵白中含量仅次于卵白蛋白的第二大蛋白质，由686个氨基酸组成，分子量为78 kDa[13]。研究表明，OTF具有多种生物活性，如免疫调节和抗病毒作用[14]。此外，先前研究显示，经商业酶处理的OTF水解物比原始蛋白具有更强的生物活性，并展现出新的生物功能[15]。已有研究探讨了OTF在H₂O₂处理后的SH-SY5Y细胞中的神经保护作用，但其水解物尚未被深入研究[16]。

在本研究中，使用四种不同的商业内肽酶对OTF进行酶解，以制备水解物并评估其对SH-SY5Y细胞氧化应激的神经保护效果。随后选出了最有效的水解物，并通过研究其凋亡途径明确了其作用机制。

研究方法

OTF及其水解物的制备

OTF的提取方法参照Abeyrathne等人的描述[17]，并以冻干形式保存在深冻柜中。使用四种不同的蛋白酶（Neutrase，诺维信公司，丹麦Bagsv?rd；胃蛋白酶，Sigma-Aldrich公司，美国密苏里州圣路易斯；Protamex，诺维信公司；胰蛋白酶，Sigma-Aldrich公司）制备OTF水解物。将OTF溶解在蒸馏水中（浓度为20 mg/mL），然后按1:100的比例加入相应的蛋白酶。含有Neutrase、Protamex和胰蛋白酶的溶液分别进行反应

OTF水解物的分子量分布变化

SDS-PAGE分析结果显示（见图1）：OTF（第2道）和OTF水解物（第3–6道）表现为不同大小的蛋白质条带。OTF条带中出现了约78 kDa的蛋白质条带，表明OTF保持了其原始的分子结构；而在所有OTF水解物条带中均出现了低于15 kDa的蛋白质条带。通过SDS-PAGE分析定性评估了各水解物的水解程度。这些结果表明OTF已完全降解

讨论

人们持续研发生物活性肽，以寻找可用于功能性健康食品的新成分。鸡蛋不仅是优质的蛋白质来源，还为发现新的生物活性肽提供了丰富的素材[25]。从图1的结果可以看出，不同水解物的功能可能因所含肽序列的不同而有所差异

结论

本研究利用商业蛋白酶成功鉴定出具有显著神经保护作用的新型食品来源肽。实验结果表明，OTF与蛋白酶（特别是OHPE）联合使用后，能够保护SH-SY5Y神经元细胞免受氧化应激的损害。进一步实验表明，OHPE还具有抗氧化活性、减少细胞内ROS水平以及调节相关基因表达等神经保护作用

作者贡献声明

金亨真（Hyeong-Jin Kim）：负责撰写初稿、方法设计、实验实施及数据分析。余承宇（Seung-Woo Yu）：方法设计。金基泰（Kee-Tae Kim）：数据分析。安东旭（Dong-Uk Ahn）：实验资源协调。李娜琼（Na-Kyoung Lee）：撰写、编辑、数据可视化及项目统筹。朴贤东（Hyun-Dong Paik）：项目指导、统筹及概念构思。

资金来源

无。

利益冲突声明

作者声明不存在可能影响本研究结果的财务利益冲突或个人关系。