利用D2O标记的单细胞拉曼光谱技术解析产甲烷菌对乙酸盐胁迫的反应

《Bioresource Technology》：Deciphering acetate stress responses in methanogen using D 2O-Labeled Single-Cell Raman spectroscopy

【字体：大中小】 时间：2026年02月08日 来源：Bioresource Technology 9

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　　单细胞拉曼光谱技术揭示Methanosarcina barkeri在乙酸胁迫下的代谢重编程与表型异质性。摘要：采用D?O-SCRS系统研究Methanosarcina barkeri在50-200 mM乙酸浓度下的生理响应，发现高浓度（200 mM）显著抑制甲烷生成（C-D比<10%）及膜结构完整性，同时通过主成分-线性判别分析鉴定出核酸、蛋白质及脂质代谢相关的生物标志物。研究首次可视化该古菌单细胞层面的代谢适应动态，为优化厌氧消化系统提供新机制见解。

李敏|孟秀霞|聂尔奇|卢东雪|郭荣波|傅善飞|郭建华

山东理工大学化学与化学工程学院，淄博255000，中国

摘要

在厌氧消化过程中，可生物降解底物的快速降解会导致挥发性脂肪酸的积累，这是一个关键挑战。Methanosarcina barkeri表现出卓越的适应性和对乙酸的耐受性，但其单细胞层面的机制尚未完全明了。我们利用重水标记的单细胞拉曼光谱（D₂O-SCRS）技术，研究了M. barkeri对不同乙酸浓度梯度的生理和代谢响应。高浓度乙酸（200 mM）抑制了甲烷的产生和微生物生长。拉曼分析显示，乙酸浓度越高，抑制作用越明显：C-D比值（代谢活性标志物）在200 mM时降至10%以下，而在50 mM和100 mM时为10–30%。多变量分析表明，在乙酸胁迫下发生了代谢重编程和明显的表型转变。主成分-线性判别分析确定了核酸、蛋白质和脂质的生物标志物，表明细胞功能受到了干扰。这些发现为了解M. barkeri的适应策略提供了单细胞层面的见解，并突显了D₂O-SCRS技术在研究厌氧生态系统中古菌响应方面的价值。

引言

厌氧消化（AD）是处理有机废物的重要生物技术，但它面临一个重大挑战：易生物降解底物的快速降解会导致挥发性脂肪酸（VFAs）的积累（Nie等人，2022b）。关键在于，高浓度的VFAs与氨之间的相互作用常常会在AD系统中引发“稳态抑制”（Nie等人，2022a），这是AD工厂常见的运行问题。在工程化的AD系统中，乙酸浓度通常保持在300 mM以下（De Vrieze等人，2015；Luo等人，2016）。值得注意的是，当乙酸浓度升高（例如从50 mM升至250 mM）时，主要的甲烷生成途径会从乙酸裂解型转变为氢营养型甲烷生成（Lü等人，2013）。在甲烷生成菌中，Methanosarcina barkeri由于其独特的代谢特性而具有卓越的适应性：四种不同的甲烷生成途径（Welander & Metcalf，2005），双重能量保存系统（Kulkarni等人，2009），动态的代谢灵活性（Hao等人，2012；Hao等人，2013），以及多样的电子传输机制（Kulkarni等人，2018；Lovley Derek，2018）。这些特性使其对乙酸胁迫具有极高的耐受性（Kurade等人，2019；Tsapekos等人，2017），使其在AD环境中具有很强的竞争力。因此，揭示其对乙酸胁迫的响应机制对于优化AD性能至关重要。然而，目前对这些适应策略的认识仍然不完整。

近期在基因组学（Liu等人，2021）、转录组学（Duan等人，2022；He等人，2019）和蛋白质组学（Duan等人，2022；Liu等人，2023）方面的进展显著提高了我们对M. barkeri在氨胁迫条件下的响应和代谢灵活性的理解。然而，这些技术在工业应用中存在显著局限性，包括复杂性高、成本高昂以及分子层面信息有限（Muchintala等人，2020）。此外，以往的研究主要集中在群体水平上，往往忽略了代谢异质性和单细胞适应动态的关键方面。这一知识空白极大地阻碍了在古菌群体中识别和追踪具有生长停滞耐受性的细胞，尤其是那些表现出酸胁迫适应性的细胞。此外，现有的分析工具缺乏必要的灵敏度和精度，无法以单细胞分辨率监测原位的表型响应，从而限制了对微生物胁迫适应机制的深入理解。这些局限性凸显了开发快速、成本效益高且高度敏感的代谢监测技术的迫切需求。

拉曼光谱作为一种强大的解决方案，提供了无标记、非侵入性、快速且成本效益高的单细胞分辨率分析方法（Frempong等人，2024；Xu等人，2025）。单细胞拉曼光谱（SCRS）通过测量细胞生物分子的振动模式来工作，能够在单细胞分辨率下同时检测多维生化组成（拉曼带波数）和含量（拉曼带强度）。这种方法在检测细胞群体对环境刺激的代谢响应方面表现出极高的灵敏度（Teng等人，2016）。与传统依赖形态评估或细胞完整性的方法不同，SCRS无需标记，并适用于多种细胞类型。当与稳定同位素标记（如D₂O）结合使用时，SCRS成为一种强大的代谢活性探针，可用于定量原位分析甲烷生成菌，无论其生长能力如何（Liu等人，2023；Yang等人，2019）。尽管这些优势凸显了SCRS在追踪受胁迫微生物动态生理变化方面的巨大潜力，但目前尚无研究将这项技术应用于AD系统中的M. barkeri》。特别是，关于其在胁迫条件下的代谢活性、表型分化和生理特征演变的知识仍然存在显著空白，需要直接的实验验证。

本研究独特地采用了重水（D₂O）耦合的单细胞拉曼光谱技术，来研究模型甲烷生成菌M. barkeri对乙酸胁迫的代谢响应演变。我们系统地描述了其在不同乙酸浓度下的代谢活性动态、表型适应和生理状态调节，揭示了这种古菌的新适应机制。该方法首次实现了对该关键甲烷生成菌单细胞异质性和适应轨迹的可视化，克服了传统群体水平分析的局限性。这些结果为开发高效的AD系统微生物管理策略奠定了基础。

培养和生长条件

M. barkeri MS（菌株DSM 800）来自德国微生物和细胞培养物收藏中心（DSMZ）。原始培养物在无菌乙酸培养基（AG培养基；成分见表S1）中生长。M. barkeri被接种到装有100 mL培养基的250 mL血清瓶中，瓶内充有N₂/CO₂气氛。密封的瓶子在37°C下静态培养，定期释放瓶内气体以平衡压力。通过定期测量光密度来监测生长情况。

乙酸胁迫对甲烷生成性能的影响

先前的研究表明，游离乙酸在甲烷生成过程中既可作为底物也可作为抑制剂（Fukuzaki等人，1990）。本研究具体探讨了不同乙酸浓度对M. barkeri的抑制作用。初始采样点显示总乙酸和游离乙酸浓度存在显著差异（p 表S2），证实了各组之间的乙酸胁迫水平不同。在20天内，乙酸的降解率超过了60%

结论

本研究利用D₂O-SCRS结合多变量分析，研究了M. barkeri在单细胞水平上对乙酸胁迫的响应。观察到浓度依赖性效应：中等浓度的乙酸（50–100 mM）增强了代谢活性和甲烷产生，而高浓度乙酸（200 mM）则导致严重的代谢抑制、膜损伤以及蛋白质和核酸降解。时间分辨的拉曼分析揭示了动态的代谢重编程和表型异质性

未引用的参考文献

Liu等人，2023；Nie等人，2022。

CRediT作者贡献声明

李敏：撰写 – 审稿与编辑，数据管理。孟秀霞：方法学，数据管理。聂尔奇：撰写 – 审稿与编辑，初稿撰写，方法学，资金获取，数据管理。卢东雪：数据管理。郭荣波：撰写 – 审稿与编辑，数据管理。傅善飞：撰写 – 审稿与编辑，项目管理，资金获取。郭建华：撰写 – 审稿与编辑。