基于DNA八面体构建的分子内熵驱动放大器能够实现与癌症相关的两种长非编码RNA的快速成像

《Biosensors and Bioelectronics》：Intramolecular entropy-driven amplifier assembled on a DNA octahedron enables rapid imaging of dual cancer-related long noncoding RNAs

DNA八面体集成熵驱动催化系统实现MALAT1和HOTAIR双lncRNA快速高灵敏度成像（0.66 fM/0.93 fM），突破传统检测方法局限，通过空间限制效应加速反应动力学，支持单细胞水平定量及活细胞动态监测，为肿瘤诊断提供新工具。

刘晓飞|袁慧敏|卢军|马飞|张春阳

东南大学化学与化学工程学院，数字医学工程国家重点实验室，南京 211189，中国

摘要

长链非编码RNA（lncRNA）是一类关键的转录调控因子，其失调与多种癌症相关。传统的熵驱动催化（EDC）反应速率依赖于自由反应物的扩散，导致反应动力学较慢。在本研究中，我们设计了一种基于DNA八面体的分子内熵驱动放大器，用于快速成像两种与癌症相关的lncRNA。该放大器的每个顶点上都集成了六个不同的功能模块：两个用于捕获肿瘤细胞的结合模块、两个用于识别lncRNA的识别模块以及两个用于燃料链驱动信号放大的放大模块。这种DNA八面体的设计不仅将所有功能模块整合到了一个分子支架中，还为同时检测两种与癌症相关的lncRNA提供了丰富的位点。由于DNA八面体的空间限制效应，这种整合可以有效加速反应动力学。检测可在80分钟内完成，MALAT1的检测限（LOD）为0.66 fM，HOTAIR的检测限为0.93 fM。此外，该方法不仅能实现单细胞定量和准确区分癌组织和正常乳腺组织中的MALAT1和HOTAIR，还能在活细胞中快速成像这两种lncRNA。这项概念验证工作在临床诊断和术后监测方面显示出广阔的应用前景。

引言

长链非编码RNA（lncRNA）的特点是长度较长（>200个核苷酸）且没有蛋白质编码潜力（St Laurent等人，2015年；Golicz等人，2018年）。最初，lncRNA被认为是基因组中的“垃圾”和转录“噪声”，被认为没有生物学功能（Miranda-Castro等人，2019年）。然而，越来越多的证据表明lncRNA在基因表达调控（如遗传印记、染色质修饰、转录激活和核运输）以及调控多种细胞行为（如增殖和凋亡）中起着重要作用（Bhan和Mandal，2015年；Zhao等人，2014年）。lncRNA的失调与多种疾病有关，包括动脉粥样硬化、阿尔茨海默病、脊髓小脑性共济失调和癌症（Gibb等人，2011年；Maass等人，2014年；Amodio等人，2018年；Flippot等人，2019年）。lncRNA表现出细胞和组织特异性模式，并是肿瘤侵袭和转移的关键驱动因素（Guttman和Rinn，2012年；Cabili等人，2015年）。由于其疾病特异性作用，lncRNA可以作为预测性生物标志物和治疗靶点。

传统的lncRNA检测技术包括微阵列（Zhang等人，2017年）、Northern印迹（Hu等人，2016年）、定量聚合酶链反应（qRT-PCR）（Zhang等人，2017年；Kolenda等人，2021年）和RNA测序（Ilott和Ponting，2013年）。然而，这些体外检测方法需要从组织或细胞样本中提取总RNA，且无法对lncRNA进行成像。杂交链反应（HCR）和催化发夹组装（CHA）已广泛应用于活细胞中的生物标志物成像（Karunanayake Mudiyanselage等人，2018年；Li等人，2023年；Cao等人，2024年；Yuan等人，2025a）。然而，这些无需酶的扩增技术依赖于碱基对形成的负自由能，可能导致高背景或由于不稳定发夹之间的非目标相互作用而产生假阳性（Liang等人，2017年；Yuan等人，2025a）。熵驱动的催化反应由熵的增加驱动，仅使用线性DNA探针进行信号放大（Zhang等人，2007年）。与基于发夹的设计相比，EDC更简单、更稳定，且没有假结和亲吻环等复杂二级结构（Liang等人，2017年；Li等人，2021年）。然而，EDC在活细胞中的应用受到探针递送困难和反应动力学缓慢的制约（Liang等人，2017年；He等人，2018年）。尽管转染试剂和无机/有机纳米材料有助于探针递送，但引入的外源物质可能会引起细胞毒性（Zhu等人，2024年）。

由于结构刚性、精确的可编程性和优异的生物相容性，通过沃森-克里克碱基配对组装的三维DNA纳米机器（如DNA四面体（Zhang等人，2022年）、DNA三角棱柱（Luo等人，2024年）和DNA纳米球（Liu等人，2020年）常用于活细胞成像领域。然而，由于RNA表达的异质性，它们大多只能针对一种RNA，无法提供可靠和全面的信息（Zhu等人，2024年）。He等人设计了一种用于TK1 mRNA成像的熵驱动DNA四面体，这种DNA四面体纳米支架的分子工程显著提高了稳定性和细胞摄取效率（He等人，2018年）。然而，由于EDC底物复合物和燃料链分别连接到两个独立的DNA四面体的顶点，这种策略存在空间阻碍大、灵敏度低和反应动力学缓慢的问题。具有六个顶点和八条边的DNA八面体可以在单个分子中提供丰富的位点，适用于多种ncRNA的检测（Zhong等人，2018年；Wang等人，2020年；Zhu等人，2024年）。在本研究中，我们展示了基于DNA八面体的分子内熵驱动放大器的构建，用于快速成像多种lncRNA。这种设计不仅为检测多种lncRNA提供了丰富的位点，还将所有功能模块整合到了一个分子支架中。由于DNA八面体的空间限制效应，这种整合可以有效加速反应动力学。此外，该纳米传感器不仅能实现单细胞定量和准确区分癌组织和正常乳腺组织中的MALAT1和HOTAIR，还能在活细胞中快速成像这两种lncRNA。

部分摘要

化学物质和材料

材料与试剂、寡核苷酸序列、凝胶电泳、荧光测量、单分子检测、真实样本分析、qRT-PCR检测、DNA八面体探针的详细分子结构、DNA八面体的两步分层自组装、一步组装、实验条件优化、DNA八面体的稳定性、DNA八面体探针的成像性能提升和细胞摄取、MALAT1和HOTAIR的成像

两种与癌症相关的lncRNA成像原理

在这项概念验证研究中，我们设计了一种基于DNA八面体的分子内熵驱动放大器，用于快速成像两种与癌症相关的lncRNA（图1）。我们选择了两种关键的与癌症相关的lncRNA作为模型目标：转移相关肺腺癌转录本1（MALAT1）和HOX转录本反义基因间RNA（HOTAIR）。MALAT1在多种恶性肿瘤中上调，促进肿瘤生长（Qiu等人，2018年）。HOTAIR的上调

结论

总之，我们通过概念验证展示了基于DNA八面体的分子内熵驱动放大器的构建，实现了两种与癌症相关的lncRNA的快速成像。与现有的lncRNA检测方法（表S2）和其他无需酶的扩增技术（如基于CHA和HCR的活细胞成像方法，表S3）相比，这种工程化的分子内熵驱动放大器具有显著优势：

CRediT作者贡献声明

张春阳：撰写 – 审稿与编辑、资金获取、概念构思。马飞：撰写 – 审稿与编辑、资金获取、概念构思。刘晓飞：撰写 – 原稿撰写、实验研究、概念构思。卢军：撰写 – 原稿撰写、实验研究、概念构思。袁慧敏：撰写 – 原稿撰写、实验研究、概念构思

未引用的参考文献

Zhang等人，2017年。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

作者感谢江苏省前沿技术研发计划（BF2024063）的财政支持。