基于T7–CRISPR/Cas13a级联系统和CsPbBr3@PDA@Au钙钛矿界面的双模式电化学发光/表面增强Raman散射（SERS）生物传感器，用于检测B型利钠肽

《Biosensors and Bioelectronics》：A Dual-Mode Electrochemiluminescence/SERS Biosensor for B-Type Natriuretic Peptide Based on a T7–CRISPR/Cas13a Cascade and a CsPbBr 3@PDA@Au Perovskite Interface

双模式电化学发光/表面增强拉曼散射传感器通过整合split-aptamer识别、T7转录-Cas13a切割级联放大和探针剥离机制实现抗干扰比率检测，在复杂生物样本中实现0-10? aM宽量程的BNP高灵敏度检测。

杨莉|任浩珍|吴润泽|王嘉辉|龚元勋|唐倩丽|廖贤久|张凯|黄龙建|魏继华

中国广西壮族自治区民族医药大学附属医院骨科与关节退行性疾病临床前与转化研究重点实验室，533000 白塞

摘要

B型利钠肽（BNP）是心血管疾病的重要生物标志物，需要在复杂基质中进行敏感且稳健的定量分析。本文报道了一种单电极、反相关的双模式电化学发光/表面增强拉曼散射（ECL/SERS）生物传感器，该传感器将分裂适配体识别与溶液相T7转录-CRISPR/Cas13a级联反应以及界面位点介导的链位移“探针剥离”转导机制结合在CsPbBr?@PDA@Au修饰的玻璃碳电极上。BNP结合后释放活性T7模板，生成触发RNA，激活Cas13a进行旁路切割，产生用于界面解锁的启动子链。界面反应会去除铁氰化物/拉曼共标记的探针，使ECL信号与SERS信号同步开启，从而实现比率定量（R = I_ECL/I_SERS），抑制共模变异。该传感器能够在0–10^6 aM的浓度范围内对BNP进行检测，具有对数线性校准和连续的比率响应。通过多种干扰物及结构相关的肽NT-proBNP（同样浓度为10^6 aM）的验证，显示其比率变化可忽略不计。血清样本评估和稳定性测试进一步证明了其在复杂基质中的可行性。这项工作建立了一种级联到界面的比率检测策略，用于实现稳健的蛋白质生物传感。

引言

B型利钠肽（BNP）主要在心室肌扩张和压力负荷下释放（Gong等人，2024；Wang等人，2023；Weber，2005）。循环中的BNP与NT-proBNP已成为心力衰竭诊断、风险分层和治疗监测的基石生物标志物（Alcidi，2022；Cardarelli，2003）。更重要的是，BNP是一个动态指标：其水平上升反映了心室壁应力的恶化，而干预后的下降则表明功能恢复和康复（de Lemos，2002）。因此，能够在复杂生物流体中敏感可靠地定量BNP的分析工具不仅对早期诊断有用，也对治疗效果和康复过程的纵向评估至关重要（Holditch，2015）。 传统的BNP检测方法（如ELISA和自动化化学发光免疫测定）虽然提供了可靠的定量结果，但通常需要集中式实验室、多个洗涤步骤以及相对较大的样本体积（Torma，2017）。这些工作流程和仪器限制了其在床旁检测和持续监测中的应用。此外，在血清中同时实现超高灵敏度和操作稳健性仍然具有挑战性，因为非特异性吸附、光学漂移和基质效应可能会扭曲单通道读数。这些实际限制推动了可微型化的生物传感器的发展，这些传感器结合了强大的放大能力和自校准、抗干扰的信号输出（Samad，2023）。 CRISPR/Cas系统最近作为生物传感的强大放大模块而出现（Gong等人，2025；Li等人，2023a；Luo等人，2026；Tang等人，2024；Zhuo等人，2023）。特别是Cas13a是一种RNA引导的核糖核酸酶，一旦被特定RNA靶标激活，会表现出强烈的旁路切割能力（Huang等人，2025a；Huang等人，2025b）。将Cas13a与T7 RNA聚合酶转录结合，可以实现等温的“识别→转录→旁路切割”放大级联反应，将低丰度靶标转化为丰富的核酸触发剂（Chen等人，2023；Dong等人，2023；Liu等人，2022）。然而，大多数基于CRISPR的生物传感器仍然依赖于单一的光学或电化学通道，这使得它们容易受到环境或电极间变异的影响。将CRISPR切割转化为在固液界面上的稳健定量信号，并实现比率自校正，仍然是一个重要目标。 电化学发光（ECL）和表面增强拉曼散射（SERS）是高度互补的转导模式（Li等人，2023b；Li等人，2023c；Li等人，2023d；Liu等人，2023；Ma等人，2026）。ECL提供接近零的光学背景和由电化学势驱动的可控发射，而SERS则提供窄光谱特征和在等离子体热点处的强增强效果。铅卤化物钙钛矿（如CsPbBr?）因其高亮度和有利的电荷转移特性而成为有吸引力的ECL发光体，但其水溶性不稳定限制了其直接用于生物传感（Luo等人，2026；Ma等人，2026；Parihar等人，2022；Protesescu等人，2021）。多巴胺（PDA）可以形成保形粘合涂层，稳定钙钛矿在水中的稳定性，并提供用于进一步功能化的儿茶酚/胺基团。随后的金纳米粒子修饰在钙钛矿表面创建了大量热点，使CsPbBr?@PDA@Au薄膜能够作为紧凑的单电极双模式ECL/SERS换能器。尽管有这些优势，但将T7–Cas13a放大级联与基于钙钛矿的双模式界面结合，以生成反相关的比率ECL/SERS信号用于蛋白质生物标志物的研究仍很少。 尽管CRISPR-ECL生物传感器取得了快速进展，但大多数报道的平台仍然依赖于单强度输出进行定量，这在实际测量中可能会受到共模变异的影响，例如电极间的换能器负载差异、微粗糙度、激发/收集效率的波动以及基质依赖的衰减或散射。虽然已经探索了双模式检测方法以提供正交信息，但当两个通道不是内在耦合到同一界面事件（或在不同基底上产生）时，第二个信号不一定能够校正这些共模漂移。在这种情况下，从同一界面生成反相关输出的单电极比率策略特别有价值，因为它能够实现内置的自归一化，并提高不同电极和不同时间点的可比性——这对于临床动态生物标志物的纵向监测至关重要。 本文报道了一种单电极、反相关的双模式ECL/SERS生物传感器，通过将溶液相T7转录-CRISPR/Cas13a级联与CsPbBr?@PDA@Au钙钛矿换能器结合在玻璃碳电极上实现BNP的检测。重要的是，由于BNP是一种蛋白质靶标，无法直接激活Cas13a，因此需要一个转导和放大级联过程，将结合事件转化为RNA触发剂，并在复杂基质条件下将触发剂的丰度提高到激活阈值以上。具体来说，BNP与分裂适配体结合后释放活性T7模板，T7转录从单次识别事件生成多个触发RNA副本，从而有效激活Cas13a；随后的旁路切割将发夹状底物转化为启动子，驱动电极界面处的位点介导的链位移反应。这种界面位移“探针剥离”作用将铁氰化物/拉曼染料共标记的DNA纳米探针从钙钛矿表面移除，同时释放Fc淬灭剂以开启ECL信号，并从金热点处移除拉曼报告剂以关闭SERS信号，从而产生物理耦合的比率读数（R = I_ECL/I_SERS）。通过这种界面耦合的比率设计，我们表征了CsPbBr?@PDA@Au纳米复合材料，验证了逐步电极组装和转录-Cas13a级联的可行性，优化了关键的转录/Cas13a参数，并展示了在宽工作范围内的超灵敏BNP检测。选择性、稳定性和血清样本评估进一步证明了比率双模式读数在复杂基质中的稳健性，适用于可靠的BNP定量。

适配体/T7双链、DNP探针和BNP标准品的制备

所有DNA/RNA储备液均溶于无核酸酶的水中，浓度为100 μM。适配体和T7 Temp（均溶于1× T7缓冲液中，浓度为2.0 μM）通过加热至90°C 5分钟并以1°C/min的速度冷却至25°C进行退火处理，然后稀释至100 nM。DNA通过将Fc链、4-MBA链和支架以1:1:1的比例（每种2.0 μM，溶于Tris–HCl 10 mM，pH 7.4，100 mM NaCl）混合制备，并采用相同的退火程序进行退火，最后稀释至0.50 μM。BNP储备液（浓度为10.0 μg/mL）配制在含有0.1% BSA的PBS中；标准品通过连续稀释获得。

双模式BNP生物传感器的工作原理

首先构建一个适配体-阻断剂（Apt-B）双链，通过将BNP适配体（Apt-A）与含有T7转录模板部分的适配体阻断剂链杂交实现。在BNP存在下，目标分子特异性结合到适配体上，引起构象变化，使适配体阻断剂从双链中移除。释放的阻断剂链随后与含有T7启动子序列的互补DNA杂交，形成完整的双链DNA模板，用于T7 RNA的合成。

结论

本研究报道了一种单电极、反相关的双模式ECL/SERS生物传感平台，用于BNP的检测。该平台将分裂适配体识别与溶液相T7转录-CRISPR/Cas13a级联反应以及界面链位移（“探针剥离”转导机制结合在CsPbBr?@PDA@Au修饰的玻璃碳电极上。BNP结合后释放活性T7模板，生成触发RNA并激活Cas13a，后者程序性产生启动子链以解锁表面探针。

CRediT作者贡献声明

杨莉：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，项目管理，方法学，数据分析，概念化。 任浩珍：验证，监督，软件，方法学，数据分析，概念化。 廖贤久：可视化，验证，监督，软件，资金获取，数据分析，概念化。 黄龙建：验证，监督，资源管理，项目管理，研究，资金获取。 魏继华：

未引用参考文献

Alcidi等人，2022；Cardarelli和T，2003；Holditch等人，2015；Samad和Restini，2023；Torma等人，2017。

利益冲突

所有作者均声明没有可能影响本文工作的相关利益关系。

利益冲突声明

作者声明没有已知的利益冲突或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

我们衷心感谢以下机构的财政支持： 国家自然科学基金（82260532）、 广西自然科学基金（2025GXNSFHA069115）、 生命科学分析化学国家重点实验室（SKLACLS2314）、 广西骨科与关节退行性疾病基础与转化研究重点实验室（2022-220-06-202205）、 百色生物医学分析化学与临床分子诊断重点实验室（2022-38-05）。