《Biotechnology Notes》：Characterization and production of a
Bacillus mycoides Bioflocculant for sustainable effluent treatment
编辑推荐：
本研究针对传统化学絮凝剂成本高、产生有毒污泥等问题，从土壤中分离出高产絮凝剂的蕈状芽孢杆菌（Bacillus mycoides）S39菌株，通过单因素优化提高了絮凝剂产量。表征分析表明，该生物絮凝剂是一种含胺基、羟基和羧酸盐基团的结晶性多糖，其絮凝机制以吸附和聚合物桥联为主。在Ca2+活化下，其对纺织废水和钢铁废水的絮凝活性分别达到95.56%和92.84%。该絮凝剂在宽pH和温度范围内保持稳定，动力学符合准一级模型，并表现出良好的生物相容性（溶血率<5%，细胞活性>80%）。研究证实该生物絮凝剂是化学絮凝剂的有效、可持续替代品，为工业废水处理提供了新思路。
清洁的水资源对全球生存至关重要，然而，由于人口扩张、城市与工业发展以及气候危机，淡水变得日益稀缺。与此同时，全球废水产生量巨大且不断增长，未经处理的废水会导致健康与神经系统疾病，其富含的营养物质还会引发水体富营养化，消耗溶解氧。在废水处理过程中，絮凝是关键步骤，它能使水中的固体颗粒聚集形成絮体从而澄清水质。传统上，这一过程严重依赖有机或无机化学絮凝剂，但它们成本较高，会产生更多污泥，并带来环境和健康风险。相比之下，由微生物产生的生物絮凝剂作为一种天然絮凝剂，具有可生物降解、环境友好、无毒、减少二次污染等优点，且能适应更广泛的pH和温度条件，成为极具潜力的绿色替代方案。那么，能否找到一种高效、安全且适用于工业规模的微生物絮凝剂呢？
近期，发表在《Biotechnology Notes》上的一项研究对此给出了肯定的答案。该研究旨在合成一种来源于土壤细菌的生物絮凝剂，以应对上述挑战。研究人员从印度泰米尔纳德邦哥印拜陀的土壤中分离、鉴定了一株高效的生物絮凝剂生产菌——蕈状芽孢杆菌（Bacillus mycoides）S39，并通过单因素优化法提高了其产量。他们对纯化后的生物絮凝剂进行了详细表征，并评估了其在处理工业废水方面的潜在应用和动力学特性。
为开展此项研究，作者运用了多项关键技术方法。首先，通过形态学、生化及分子技术（16S rRNA基因测序与系统发育分析）对菌株进行鉴定。其次，采用单因素优化法确定了碳源、氮源、pH、温度、阳离子等最佳培养条件。生物絮凝剂的提取纯化涉及离心、乙醇沉淀及氯仿:甲醇混合溶剂处理。表征技术包括化学分析（测定总糖和蛋白含量）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）、扫描电子显微镜（SEM）、元素分析、X射线衍射（XRD）以及Zeta电位分析。安全性评估则进行了溶血实验、抗菌活性测定（最小抑菌浓度，MIC）、抗氧化活性分析（DPPH、H2O2、还原力、FRAP法）和体外细胞毒性实验（MTT法）。废水处理效能研究包括以高岭土悬液为模型的絮凝活性测试，以及应用于实际纺织和钢铁工业废水（样本来自泰米尔纳德邦的工厂）的处理，并测定了处理前后水质参数（如TSS、BOD、COD、TDS、MPN及多种营养物质）的变化。此外，还进行了动力学研究，以确定最佳投加量和反应速率常数，并评估了该生物絮凝剂在较大体积（0.01至10升）废水中的处理效果。
3.1. 菌株的分离与鉴定
从土壤样品中分离出的63株菌中，S39菌株表现出最高的絮凝活性（95.70 ± 1.04%）。经鉴定，该菌株为蕈状芽孢杆菌（Bacillus mycoides），其16S rRNA基因序列已存入GenBank（登录号OQ329975）。通过优化碳源（蔗糖）、氮源（硫酸铵）、pH（7）、温度（30°C）、阳离子（氯化钙）等条件，显著提高了生物絮凝剂的产量。
3.2. 菌株的时间进程测定
在优化条件下培养S39菌株，其生物絮凝剂产量在72小时达到峰值（91.8%的絮凝活性），此时细菌进入稳定期。生物絮凝剂的生产与细菌生长阶段密切相关，而非细胞自溶。
3.3. 纯化生物絮凝剂的表征
化学分析显示，该生物絮凝剂总糖含量为65.3%，蛋白质含量为12.83%。FTIR光谱证实其含有羟基、胺基、羧酸盐等官能团，这些基团有助于吸附和桥联作用。SEM显示其表面粗糙不规则，增大了与悬浮颗粒的接触面积，有利于形成大而致密的絮体。元素分析表明其主要由碳和氧构成。XRD分析揭示了其结晶结构。
3.4. 溶血实验
在25至1000 μg/mL的浓度范围内，生物絮凝剂引起的溶血率均低于5%（最高为5.08%），表明其具有良好的血液相容性。
3.5. 抗菌活性
该生物絮凝剂对多种水生病原菌（如肺炎克雷伯菌、沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等）显示出抗菌活性，最小抑菌浓度（MIC）在1至15 mg/mL之间，表明其具有降低废水中微生物负荷的潜力。
3.6. 抗氧化活性
通过DPPH、H2O2、还原力和FRAP等多种方法评估，该生物絮凝剂在较高浓度下表现出显著的抗氧化能力，有助于中和废水中的自由基/氧化剂。
3.7. 纯化生物絮凝剂的体外细胞毒性研究
MTT实验表明，在25至100 μg/mL浓度下处理L929小鼠成纤维细胞，细胞活性保持在81%至95.33%之间，证明其无细胞毒性。
3.8. 生物絮凝剂对絮凝活性的有效性研究
确定了生物絮凝剂的最佳应用条件：剂量为1 mg/mL，pH 7.0，温度在20-120°C范围内稳定，且需要Ca2+（1%）作为助凝剂。在这些条件下，其对高岭土悬液的絮凝活性超过96%。
3.9. 絮凝机制分析
Zeta电位测量显示，加入生物絮凝剂和Ca2+后，体系电位变得更负，表明絮凝主要通过聚合物桥联机制而非电中和实现。生物絮凝剂的长链结构能够桥接多个颗粒，形成大絮体。
3.10. 生物絮凝剂在工业废水中的应用
将该生物絮凝剂应用于纺织和钢铁工业废水，絮凝活性分别达到95.56%和92.84%。处理后，废水的总溶解固体（TDS）、生化需氧量（BOD）、化学需氧量（COD）、总悬浮固体（TSS）以及钠、硫化物、磷、氯化物、铜等多种营养物质含量均显著降低，微生物数量也减少了90%（1个对数级）。水质pH趋于中性，颜色和气味得到明显改善。
3.11. 利用纺织工业废水进行的生物絮凝剂动力学研究
动力学分析表明，染料去除过程最符合准一级动力学模型。在生物絮凝剂投加量为3 mg/mL时，反应速率常数（k）最高。该优化剂量不仅能有效去除染料，还能显著降低废水中的总溶解固体（TDS）。
3.12. 生物絮凝剂在较大体积下的絮凝活性及比较分析
将处理规模从0.01升放大到10升，生物絮凝剂在较大体积下仍能保持稳定的高絮凝活性（超过90%）。与传统的化学絮凝剂（如氯化铁、明矾、聚丙烯酰胺）相比，该生物絮凝剂对含高岭土的模拟废水表现出更优的絮凝效能（96.37 ± 1.80%）。
本研究成功分离并鉴定了蕈状芽孢杆菌S39菌株，其产生的生物絮凝剂主要成分为多糖，富含多种活性官能团。该絮凝剂具有高效、稳定（宽pH和温度范围）、安全（低溶血性、无细胞毒性）且兼具抗菌和抗氧化活性的特点。机理上，其絮凝作用主要通过聚合物桥联实现。在实际工业废水处理中，该生物絮凝剂对纺织和钢铁废水均表现出极高的去除效率，能大幅改善多项水质指标。动力学研究为其实际应用提供了优化的投加参数。更重要的是，该絮凝剂在从0.01升至10升的不同规模处理中均表现稳定，展现了良好的规模化应用前景。与常规化学絮凝剂相比，本研究开发的生物絮凝剂在效能和环境友好性上均显示出明显优势。这项研究不仅首次对该菌株用于废水处理进行了全面的动力学和放大规模评估，也为开发可持续、高效的废水处理替代方案提供了重要的实验依据和理论支持，对缓解水危机和推动绿色水处理技术发展具有重要意义。未来的研究可聚焦于利用低成本营养物质生产该生物絮凝剂，并进行全面的经济性分析。
